肠道微生态与异甘草素抗炎症相关结直肠癌作用的相关性研究
发布时间：2017-09-17 21:49
本文关键词：肠道微生态与异甘草素抗炎症相关结直肠癌作用的相关性研究
更多相关文章： BALB/c小鼠 氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠 末端限制性片段长度多态性分析 高通量测序 肠道菌群 炎症相关结直肠癌
【摘要】：背景肠道菌群失衡与炎症相关结直肠癌(CAC)的发病密切相关。一些传统中药具有调节肠道菌群的作用。异甘草素(Isoliquiritigenin,ISL)是从甘草中提取的一种查尔酮化合物。研究发现异甘草素具有多种抗癌活性。然而,目前尚未有关于异甘草素在抗结直肠癌和对肠道微生物的影响方面的相关研究报道。目的(1)对比四种从粪便中提取微生物基因组DNA的方法,从中选取高效且能更为客观全面反映粪便中微生物群落特征的提取方法。(2)分析小鼠粪便及肠道各部位内容物中细菌群落结构的差异,探讨粪便取样研究肠道微生物与疾病关系的科学性和客观性,为研究肠道微生物与疾病相关实验提供依据。(3)构建氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)小鼠模型,通过细菌16S rRNA的T-RFLP、荧光定量PCR和高通量测序技术分析对照组和模型组小鼠肠道微生物群落结构,阐述AOM/DSS模型小鼠CAC发展过程中的微生态演变规律;通过不同剂量异甘草素干预AOM/DSS模型,评估异甘草素对CAC发展的干预作用,并分析异甘草素对肠道微生态演变的影响。方法(1)在第一部分中,采用本实验室优化的GITC法、Tiangen商业试剂盒、Omega商业试剂盒和广泛应用的蛋白酶K-CTAB法从粪便样品中提取微生物总DNA,比较这四种方法提取的DNA的浓度、纯度和经PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)分析所代表样品的微生物多样性和群落结构。(2)在第二部分中,利用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和荧光定量PCR技术(qPCR)对BALB/c小鼠肠道不同部位(十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠)内容物及粪便中细菌群落组成和丰度进行比较,分析细菌群落在小鼠粪便及肠道各部位的分布差异。(3)在第三部分中:1)设置氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠(AOM/DSS)诱导的炎症相关结直肠癌BALB/c小鼠组(CACM)、三个不同浓度异甘草素干预AOM/DSS诱导炎症相关结直肠癌小鼠组(150 mg/kg,CIH;75 mg/kg,CIM;30 mg/kg,CIL)、空白对照组(CK)和异甘草素对照组(ISL+CK)。2)利用荧光定量PCR分析各组小鼠肠道上皮炎性细胞因子(IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β、IKKβ)以及炎症因子COX-2的变化;将肠组织切片进行HE染色分析各组小鼠肠上皮病理变化,评估AOM/DSS诱导炎症相关结直肠癌进程以及异甘草素对小鼠肠道的保护作用。3)通过末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)和高通量测序方法分析小鼠肠道细菌群落结构演变,分析异甘草素对炎症相关结直肠癌小鼠肠道菌群的影响。4)结合小鼠肠上皮组织病理特征和肠道菌群结构特点,综合分析肠道菌群在异甘草素干预炎症相关结直肠癌发生发展过程中的作用。结果(1)四种从粪便中提取粪便中微生物基因组DNA对比结果:1)商业试剂盒提取的DNA纯度最高但是浓度最低;蛋白酶K-CTAB所得的DNA浓度最高但是纯度最低;GITC法所得DNA的浓度高于商业试剂盒,纯度高于蛋白酶K-CTAB法。2)细菌16S rRNA的PCR-DGGE分析结果表明,GITC法提取得到DNA所代表细菌的丰富度和多样性显著高于其他三种方法。本实验室所优化的GITC法可最为全面地反映小鼠粪便细菌群落结构组成。(2)小鼠粪便及肠道各部位内容物细菌群落结构分析结果:1)粪便与直肠、结肠中优势片段均为244 bp、255 bp和449 bp,而小肠内容物(十二指肠、空肠及回肠)的优势片段则为60 bp、73 bp、261 bp、268 bp和272 bp,且小肠各部位之间细菌群落结构差异较大。粪便样品可客观反映小鼠结直肠部位肠道菌群组成。2)十二指肠和空肠内容物中的细菌丰度较低,分别为6.9 log(copies)/g和8.3log(copies)/g,而粪便中细菌丰度高达11.8 log(copies)/g,约2倍于十二指肠细菌丰度,显著高于十二指肠和空肠(P0.05),与大肠各部位及回肠内容物细菌丰度相当,差异不显著(P0.05)。(3)异甘草素通过调节肠道微生物抑制小鼠炎症相关结直肠癌结果:1)组织病理学分析表明异甘草素可显著下调与炎症相关的细胞因子并抑制AOM/DSS小鼠模型中肿瘤的发生率。2)基于T-RFLP的CA分析表明,在AOM/DSS诱导的CAC发展过程中,小鼠肠道微生物群落结构发生显著变化,而ISL能在一定程度上抑制CAC对肠道微生物群落结构的影响,且ISL不会改变正常小鼠肠道微生物群落结构。3)基于细菌16S rRNA的高通量测序结果表明,肠道微生物在AOM/DSS诱导的CAC小鼠肠道和异甘草素干预下的CAC小鼠肠道中均发生显著变化。与健康小鼠相比,CAC发生时拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度降低,厚壁菌门(Firmicutes)丰度增加;异甘草素能逆转这种菌门水平上的不平衡。抗CAC的同时,异甘草素能调节肠道菌群,尤其是在科的水平上:异甘草素显著下调毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的丰度,增加螺杆菌科(Helicobacteraceae)的丰度;除毛螺旋菌科外,经过异甘草素治疗后的小鼠肠道菌群与健康小鼠肠道菌群在科分类水平上无显著差异。在属的水平上,异甘草素降低了一些机会致病菌的丰度,如埃希菌属(Escherichia)和肠球菌属(Enterococcus);同时异甘草素增加了一些丁酸盐产生菌的丰度,如Butyricicoccus、Clostridium和Ruminococcus。结论(1)商业试剂盒提取的粪便微生物基因组DNA纯度较高,但是浓度较低且成本高,适合于高通量测序等需要高纯度低浓度的微生物分析方法;本实验室优化的GITC法提取的粪便微生物总DNA能更全面地反应肠道微生物的多样性和群落结构,且成本较低,因此适合于实验室对实验样品的一般性分析研究。(2)粪便和大肠各部位内容物的细菌群落结构个体差异较小肠小,适合进行肠道微生态与疾病发生发展的相关科学研究;粪便与大肠特别是结直肠部位细菌群落组成相似,可通过粪便取样进行该部位的微生物生态学相关分析。(3)明确了异甘草素的抗炎症相关结直肠癌的作用。在异甘草素抑制炎症相关结直肠癌的过程中,肠道微生物群落结构亦发生显著变化。AOM/DSS诱导的炎症相关结直肠癌导致的肠道微生物群落结构的改变可被异甘草素在一定程度上逆转。这种逆转过程包括一些益生菌的增加,如Prevotella、Butyricicoccus、Clostridium和Ruminococcus;一些机会致病菌的减少,如Escherichia和Enterococcus。异甘草素在抗癌过程中改变的这些微生物可能会协同其抗癌效果。同时,本研究对传统中药在发挥抗癌活性时也会调节肠道菌群方面有提供了新的证据。以后更多的研究将聚焦于异甘草素抗癌的具体分子机制。
【关键词】：BALB/c小鼠 氧化偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠 末端限制性片段长度多态性分析 高通量测序 肠道菌群 炎症相关结直肠癌
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
【目录】：
- 摘要5-9
- Abstract9-13
- 前言13-16
- 第一部分 对比四种提小鼠粪便中微生物基因组DNA的方法16-30
- 1 研究材料16-18
- 2 实验方法18-26
- 3 结果26-30
- 第二部分 小鼠粪便及肠道各部位内容物细菌群落结构差异分析30-41
- 1 研究材料30-31
- 2 实验方法31-36
- 3 结果36-41
- 第三部分 异甘草素通过调节肠道微生物抑制小鼠炎症相关结直肠癌41-66
- 1 研究材料41-44
- 2 实验方法44-51
- 3 结果51-66
- 讨论66-71
- 结论71-72
- 参考文献72-80
- 综述：结直肠癌潜在微生物标记物的研究进展80-89
- 参考文献85-89
- 附录89-91
- 攻读学位期间发表文章情况91-92
- 致谢92-93
- 个人简历93
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 汪云,曹玉华;毛细管电泳法测定甘草中的甘草素和异甘草素[J];分析测试学报;2004年04期
2 张晶;杨静;吴基良;詹春;张琳;;异甘草素脂质体的制备及稳定性考察[J];中国医院药学杂志;2005年11期
3 慕春海;韩博;李超鹏;陈文;;多壁碳纳米管对异甘草素和甘草素的选择性吸附[J];石河子大学学报(自然科学版);2010年04期
4 黄继伟;凌新龙;林海涛;;异甘草素的简便合成研究[J];时珍国医国药;2012年10期
5 牛r嚕韧呖
本文编号：871561
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/871561.html
