miRNA-373抑制胶质瘤细胞U251迁移及侵袭作用的研究

发布时间：2017-09-18 04:35

  本文关键词：miRNA-373抑制胶质瘤细胞U251迁移及侵袭作用的研究

  更多相关文章： 胶质瘤 miRNA-373 CD44 TGFBR2 迁移 侵袭

【摘要】：胶质母细胞瘤(glioblastomamultiforme,GBM)是成人最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,具有生长迅速、侵袭能力强、恶性程度高以及易复发等潜能。尽管在手术切除联合放射治疗和以替莫唑胺为代表的化学治疗等治疗手段下,GBM病人的五年生存率仍不到5%。研究GBM侵袭进展的分子机制,有助于设计更有效的治疗手段,阻止疾病的进展与复发。microRNAs(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的单链非编码RNAs,主要通过转录后修饰途径参与基因的表达调控。据估计,哺乳动物有超过50%的基因受到miRNAs调控。miRNAs几乎参与细胞的所有进程,包括细胞的增殖、死亡、凋亡、衰老、分化、迁移以及侵袭等。miRNAs的表达失调与肿瘤的发生发展密切相关,这些异常表达的miRNAs在肿瘤中发挥着癌基因或是抑癌基因的作用。鉴定出这些miRNAs并探究它们的功能和潜在靶点,有助于发现新的具有诊断或预后功能的标志物,并针对这些差异表达的miRNAs设计更有效的肿瘤治疗靶点。miRNA-373(miR-373)在许多肿瘤中都存在着表达失调,依据组织特异性的不同,miRNA-373在这些肿瘤中所发挥的作用也不同。有研究显示,在睾丸癌、乳腺癌、食管癌和宫颈癌中,miR-373发挥着癌基因的作用;在肺癌、胰腺癌、卵巢癌和结肠癌中,miR-373发挥着抑癌基因的作用。在胶质瘤中,miR-373的作用还未被充分的探究。本研究主要探讨miR-373在GBM细胞系U251细胞中作用,包括对其增殖、迁移与侵袭的影响,并进一步分析其发挥作用的功能靶点并对靶点进行验证。目的:通过体外细胞实验探究miR-373对胶质瘤细胞系U251增殖、迁移及侵袭的影响,并对相关机制做进一步分析。方法:1.MTT法检测miR-373对U251增殖的影响。流式细胞术检测miR-373对U251细胞凋亡的影响。2.细胞划痕实验检测miR-373对U251细胞横向迁移能力的影响。Transwell小室迁移及侵袭实验分析miR-373对U251纵向迁移能力及侵袭能力的影响。3.通过在线靶基因预测软件和文献检索寻找miR-373发挥作用的功能靶点。双荧光素酶报告基因实验验证miR-373是否直接靶向靶基因mRNA的3’UTR端。4.RNA干扰和靶基因回复实验验证miR-373的功能靶点。结果:1.尽管过表达miR-373不影响U251的增殖、死亡与凋亡,但发现转染miR-373模拟剂48小时后,与转染miR-NC的对照组细胞相比,细胞变得圆钝,触角减少,说明miR-373可能影响U251细胞的运动能力。2.细胞划痕实验和Transwell小室迁移与侵袭实验显示,过表达miR-373明显抑制U251的迁移和侵袭。3.通过靶基因预测软件分析和文献检索,选取了2个可能与miR-373抑制迁移与侵袭相关的靶基因:CD44和TGFBR2,用qRT-PCR检测CD44与TGFBR2mRNA表达量的变化,发现miR-373明显下调CD44与TGFBR2mRNA表达。WesternBlot结果证实miR-373能明显下调CD44与TGFBR2蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验证实miR-373直接作用于CD44和TGFBR2的3’UTR端。4.RNAi分别敲低CD44与TGFBR2后,U251细胞迁移与侵袭能力都受到抑制,这与过表达miR-373后对U251的影响一致。靶基因回复实验显示,回复了U251细胞中CD44或TGFBR2的表达后,部分抵消了过表达miR-373后对细胞迁移与侵袭的抑制作用,这说明miR-373抑制U251迁移与侵袭的机制与它下调CD44和TGFBR2有关。结论:1.miR-373尽管对U251的增殖无明显作用,但能明显减弱细胞的运动能力,抑制细胞的迁移以及侵袭。2.CD44与TGFBR2是miR-373的两个直接的功能靶点。3.miR-373通过下调CD44与TGFBR2的表达发挥抑制U251迁移与侵袭的用。4.miR-373能够抑制由TGF-β所诱导的迁移与侵袭。
【关键词】：胶质瘤 miRNA-373 CD44 TGFBR2 迁移 侵袭
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 主要符号表11-13
• 前言13-17
• 材料与方法17-35
• 1.1 主要实验试剂及耗材17-20
• 1.2 主要仪器20-21
• 1.3 实验方法21-35
• 1.3.1 细胞培养21
• 1.3.2 细胞转染实验21-23
• 1.3.3 MTT法检测细胞增殖23
• 1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡23-24
• 1.3.5 细胞划痕实验与Transwell小室实验检测细胞迁移与侵袭24-25
• 1.3.6 提取细胞总蛋白并行Western blot实验检测蛋白表达量25-28
• 1.3.7 提取总RNAs和miRNAs28-30
• 1.3.8 q RT-PCR实验检测m RNA以及miRNA表达水平30-33
• 1.3.9 双荧光素酶报告基因实验33
• 1.3.10 靶基因回复实验33-34
• 1.3.11 统计学方法34-35
• 结果35-49
• 1.1 miR-373 不影响U251细胞生长35-39
• 1.1.1 MTT细胞增殖实验检测miR-373 对U251增殖影响37-38
• 1.1.2 流式细胞术检测miR-373 对U251凋亡的影响38-39
• 1.2 miR-373 抑制U251迁移及侵袭39-42
• 1.2.1 细胞划痕实验检测miR-373 对U251横向迁移能力的影响40
• 1.2.2 Transwell迁移实验检测miR-373 对U251纵向迁移能力影响40-41
• 1.2.3 Transwell侵袭实验检测miR-373 对U251侵袭能力影响41-42
• 1.3 miR-373 下调CD44与TGFBR2表达，，两者均为miR-373 的靶基因42-48
• 1.3.1 miR-373 下调CD44与TGFBR2表达42-44
• 1.3.2 双荧光素酶报告实验验证CD44与TGFBR2是miR-373 的靶点44-46
• 1.3.3 miR-373 通过下调CD44与TGFBR2发挥抑制迁移和侵袭作用46-48
• 1.4 miR-373 能够抑制由TGF-β 诱导的U251的迁移和侵袭48-49
• 讨论49-54
• 结论54-55
• 参考文献55-61
• 攻读硕士学位期间发表的论文61-62
• 致谢62

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