巨噬细胞极化微环境促肺癌发生与药物治疗

发布时间：2017-09-18 08:45

  本文关键词：巨噬细胞极化微环境促肺癌发生与药物治疗

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【摘要】：肿瘤的恶性进展与巨噬细胞极化微环境密切相关。在肿瘤的形成中,极化的M2型巨噬细胞创造了一种炎性环境促进肿瘤生长。然而,巨噬细胞极化微环境与肿瘤进展是否有直接关系,至今尚无定论。因此,明确巨噬细胞极化微环境促进肿瘤发展的机制对肿瘤治疗甚为关键。本课题以肺癌为研究对象,目的是研究巨噬细胞极化微环境对肺癌的促进及药物治疗,以期为肺癌防治提供有效措施。本研究首先考察体外巨噬细胞极化微环境对LLC细胞是否有直接影响,采用小鼠腹腔巨噬细胞(PEMs),用LPS(10 ng/ml)将PEMs极化为M1型巨噬细胞;用IL-4(10 ng/ml)诱导PEMs为M2型巨噬细胞;通过荧光双染法检测极化的巨噬细胞与LLC细胞共培养;MTT法和PCNA免疫荧光法检测巨噬细胞条件培养基对LLC细胞增殖影响;细胞划痕实验、Transwell实验分析巨噬细胞条件培养基对LLC细胞迁移、侵袭的关系。此外,本课题还研究了体外巨噬细胞极化微环境对新生血管生成的影响,MTT法和PCNA免疫荧光法检测巨噬细胞条件培养基对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的促增殖作用;伊文斯兰渗出法检测HUVEC细胞体外通透性;鸡胚尿囊膜(CAM)模型研究巨噬细胞条件培养基对新生血管形成的影响。接着,为探索巨噬细胞极化微环境促癌机制,我们用AO/EB荧光双染法检测细胞凋亡;免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3-B、P62表达;DQ-Green BSA降解实验观察细胞溶酶体活性;DAF-2 DA和DCF-DA分别检测细胞内NO和ROS。最后,我们建立乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型,流式细胞术和Western Blot检测肺癌小鼠肺泡细胞中巨噬细胞表型;ELISA试剂盒检测肺癌小鼠血清中5-HIAA和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-4含量;免疫组化法检测小鼠肺组织中LC3-B、P62和CD31蛋白的表达;伊文斯兰渗出法检测肺血管通透性。另外,为充分证明巨噬细胞极化微环境促进肺癌发生的机制,我们使用巨噬细胞耗竭剂、自噬抑制剂和血管保护剂治疗肺癌小鼠,观察其对肺癌发生的阻止作用。本文结果表明,M1型巨噬细胞对LLC细胞吞噬能力明显比极化前强,而M2型巨噬细胞对LLC细胞吞噬能力明显比极化前弱。极化的M1型和M2型巨噬细胞条件培养基对LLC细胞增殖、迁移、侵袭无明显影响,然而,我们意外的发现M2型巨噬细胞条件化培养基能促进体外HUVEC的增殖、增加HUVEC细胞体外通透性、诱导鸡胚尿囊膜(CAM)新生血管形成,而M1型巨噬细胞条件化培养基对此没有影响。机制研究显示,1%血清饥饿条件下,M2型巨噬细胞条件培养基明显增加HUVEC细胞自噬小体及LC3-B蛋白表达,但减少自噬底物P62蛋白和DQ-Green BSA的降解,而自噬抑制剂氯喹在不影响HUVEC细胞增殖浓度下降低HUVEC通透性。此外,我们也发现,M2型巨噬细胞条件化培养基可以增加HUVEC细胞内NO和ROS水平,使用氯喹抑制自噬后可降低细胞内NO和ROS水平。最后,我们在体内实验中观察到乌拉坦诱导的小鼠肺癌增加肺泡M2型巨噬细胞比例,促进肺组织LC3-B表达,抑制P62蛋白降解。同时,乌拉坦诱导的小鼠肺癌促进新生血管标志物CD31蛋白表达、增加血清血管紊乱标志物5-HIAA水平、提高肺血管通透性。氯屈膦酸钠脂质体诱导的M2型巨噬细胞耗竭、氯喹诱导的自噬抑制和丹酚酸B诱导的血管保护均可明显减少小鼠肺部肿瘤数、CD31蛋白表达、5-HIAA水平和肺血管通透性,降低新生血管异常和肺癌发生率。综上所述,M2型巨噬细胞微环境促进肺癌发展的机制不是直接刺激肿瘤增殖,而是通过诱导自噬性新生血管形成促进肺癌的发展。抑制M2型巨噬细胞生成、减少自噬或保护血管均可成为有前景的肺癌防治措施。
【关键词】：巨噬细胞极化 微环境 肺癌 自噬 新生血管形成
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• Abbreviation12-14
• 第一部分 绪论14-20
• 1.1 肺癌的研究现状14
• 1.2 巨噬细胞与肺癌的发生14-15
• 1.3 新生血管与肿瘤的进展15-17
• 1.4 自噬与肺癌的恶化17-20
• 第二部分 巨噬细胞极化对LLC细胞作用研究20-36
• 2.1 前言20-21
• 2.2 实验材料21-23
• 2.2.1 试剂材料21
• 2.2.2 试剂配制21-22
• 2.2.3 实验细胞22-23
• 2.2.4 实验动物23
• 2.2.5 主要仪器23
• 2.3 实验方法23-26
• 2.3.1 腹腔巨噬细胞分离与纯化23
• 2.3.2 巨噬细胞极化及收集巨噬细胞极化条件培养基23-24
• 2.3.3 流式细胞术（FCM）检测巨噬细胞表型24
• 2.3.4 巨噬细胞吞噬LLC细胞实验24
• 2.3.5 MTT法检测细胞增殖实验24-25
• 2.3.6 PCNA免疫荧光法检测细胞增殖实验25
• 2.3.7 细胞划痕实验25
• 2.3.8 Transwell实验25-26
• 2.3.9 统计学分析26
• 2.4 实验结果26-34
• 2.4.1 小鼠腹腔巨噬细胞诱导前后形态变化26
• 2.4.2 巨噬细胞极化26-27
• 2.4.3 巨噬细胞吞噬LLC细胞实验27-28
• 2.4.4 巨噬细胞极化条件培养基对LLC细胞增殖的影响28-31
• 2.4.5 巨噬细胞极化条件培养基对LLC细胞迁移能力的影响31-32
• 2.4.6 巨噬细胞极化条件培养基对LLC细胞侵袭能力的影响32-34
• 2.5 实验小结34-36
• 第三部分 巨噬细胞极化对体外新生血管的影响36-42
• 3.1 前言36
• 3.2 实验材料36-37
• 3.2.1 试剂材料36
• 3.2.2 实验动物36-37
• 3.2.3 实验细胞37
• 3.2.4 实验仪器37
• 3.3 实验方法37-38
• 3.3.1 MTT法检测HUVEC细胞增殖37
• 3.3.2 PCNA免疫荧光法检测HUVEC细胞增殖37
• 3.3.3 伊文斯兰渗出法检测HUVEC细胞通透性37
• 3.3.4 鸡胚尿囊膜（CAM）法检测巨噬细胞对体外血管生成的影响37-38
• 3.3.5 统计学分析38
• 3.4 实验结果38-41
• 3.4.1 巨噬细胞极化对HUVEC细胞增殖的影响38-39
• 3.4.2 伊文斯兰渗出法检测HUVEC细胞体外通透性39-40
• 3.4.3 鸡胚尿囊膜实验检测巨噬细胞对新生血管的影响40-41
• 3.5 实验小结41-42
• 第四部分 巨噬细胞极化对HUVEC细胞自噬的影响42-58
• 4.1 前言42-43
• 4.2 实验材料43
• 4.2.1 实验试剂43
• 4.2.2 实验细胞43
• 4.2.3 实验仪器43
• 4.3 实验方法43-45
• 4.3.1 AO染色检测HUVEC细胞自噬小体形成43-44
• 4.3.2 免疫荧光检测HUVEC自噬相关蛋白表达44
• 4.3.3 DQ-Green BSA检测溶酶体活性44
• 4.3.4 HUVEC细胞中NO含量检测44-45
• 4.3.5 HUVEC细胞中ROS含量检测45
• 4.3.6 AO/EB染色检测HUVEC细胞凋亡45
• 4.4 实验结果45-56
• 4.4.1 AO染色检测HUVEC细胞自噬小体形成45-47
• 4.4.2 LC3-B蛋白形成检测47-48
• 4.4.3 P62蛋白降解检测48-50
• 4.4.4 DQ-Green BSA检测自噬降解情况50-51
• 4.4.5 AO/EB检测HUVEC细胞凋亡51-53
• 4.4.6 DAF-2DA检测HUVEC细胞NO生成53-54
• 4.4.7 DCF-DA检测HUVEC细胞内ROS生成54-56
• 4.5 实验小结56-58
• 第五部分 巨噬细胞对体内肺癌模型发展的影响58-78
• 5.1 前言58-59
• 5.2 实验材料59-61
• 5.2.1 实验试剂59
• 5.2.2 实验试剂配制59-60
• 5.2.3 实验动物60
• 5.2.4 实验仪器60-61
• 5.3 实验方法61-66
• 5.3.1 小鼠肺组织中巨噬细胞表型检测61-62
• 5.3.2 肺癌组织HE染色62-63
• 5.3.3 免疫组化法检测肺组织中P62、LC3-B、CD31蛋白表达63-64
• 5.3.4 Western Blot方法64-66
• 5.4 实验结果66-77
• 5.4.1 乌拉坦诱导对小鼠体征的影响66-68
• 5.4.2 乌拉坦诱导对小鼠血清中 5-HIAA水平的影响68
• 5.4.3 乌拉坦诱导对小鼠肺泡细胞中巨噬细胞表型的影响68-70
• 5.4.4 药物干预对乌拉坦诱导的小鼠肺癌模型的病理特征的影响70-71
• 5.4.5 乌拉坦诱导对小鼠肺组织自噬相关蛋白表达的影响71-72
• 5.4.6 药物干预对乌拉坦诱导小鼠肺新生血管的影响72-74
• 5.4.7 药物干预对乌拉坦诱导小鼠肺血管通透性的影响74
• 5.4.8 药物干预对乌拉坦诱导小鼠肺重量和肿瘤数的影响74-77
• 5.5 实验小结77-78
• 第六部分 讨论78-80
• 第七部分 实验结论80-82
• 第八部分 论文创新点82-84
• 参考文献84-92
• 致谢92-94
• 攻读学位期间发表的学术论文目录94-95

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