长链非编码RNA分子UCA1介导胃癌多药耐药的机制研究

发布时间：2017-09-18 22:16

  本文关键词：长链非编码RNA分子UCA1介导胃癌多药耐药的机制研究

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【摘要】：【背景】胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,化疗是治疗中晚期胃癌的重要手段,多药耐药是胃癌患者化疗失败的主要原因。肿瘤耐药机制十分复杂,既往研究主要集中在仅占基因组2%左右的蛋白编码基因上,显然不能根本阐明肿瘤复杂的耐药机制。而占基因组98%的非编码基因在近年来越来越受到人们重视,成为攻克肿瘤耐药难题的希望所在。非编码基因转录产生非编码RNA,包括长链非编码RNA和短链非编码RNA,其中以长链非编码RNA为主要组成部分。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lnc RNA)是一类转录本长度超过200个核苷酸的非编码RNA分子,其不编码蛋白,而是以RNA的形式通过多种机制参与基因表达调控。近年来,lnc RNA已被证实在肿瘤的增殖、转移和耐药中发挥了重要调节作用,然而目前lnc RNA在胃癌多药耐药中的作用尚不清楚。前期,我们通过高通量表达谱芯片筛选得到了一批在胃癌多药耐药细胞差异表达的lnc RNA和mi RNA分子。本研究综合分析芯片中差异表达的lnc RNA分子,发现UCA1与胃癌耐药密切相关,并通过体内外实验验证了UCA1在胃癌耐药中的作用。其后,结合mi RNA芯片数据通过生物信息学分析找到了与UCA1相互作用的mi RNA let-7,并通过分子生物学实验阐明了UCA1作为竞争内源性RNA通过结合let-7促进下游靶分子HMGA2表达,进而介导胃癌多药耐药的分子机制。【目的】1.筛选和验证胃癌耐药相关lnc RNA分子。2.通过体内外实验研究UCA1对胃癌多药耐药的调节作用。3.阐明UCA1调节胃癌多药耐药的分子机制。【方法】1.分析高通量表达谱芯片数据,筛选差异表达的lnc RNA分子,并通过q RT-PCR验证候选分子的表达。通过q RT-PCR在不同细胞系和胃癌组织中验证UCA1的表达。2.MTT实验验证UCA1对胃癌多药耐药的调节作用,流式细胞术检测细胞凋亡。裸鼠皮下移植瘤实验验证UCA1对体内胃癌细胞化疗敏感性的调节作用。3.荧光原位杂交和胞浆胞核分离实验检测UCA1的细胞内定位和分布。4.生物信息学分析预测与UCA1结合的mi RNA和蛋白,双荧光素酶报告基因实验和RIP实验分别证实UCA1与mi RNA、UCA1与蛋白的相互作用。5.通过q RT-PCR、MTT、流式细胞术检测凋亡验证let-7e和HMGA2在胃癌耐药细胞的表达及其对胃癌耐药的调节作用。western blot验证let-7e对靶基因HMGA2的负向调控关系。通过western blot和相关分析验证UCA1对HMGA2的正向调节作用。通过let-7e结合位点突变证实UCA1调节HMGA2表达需要let-7e参与。【结果】1.高通量芯片筛选获得19个在两株胃癌耐药细胞中上调表达10倍以上的lnc RNA,q RT-PCR证实UCA1在两株耐药细胞系中表达显著上调。通过q RT-PCR检测,还发现UCA1在白血病耐药细胞表达上调,在其他消化系肿瘤如胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌细胞系中,UCA1同样表达上调。临床样本中检测UCA1表达水平发现,UCA1在胃癌组织中表达显著高于配对的癌旁正常组织。2.UCA1可显著促进胃癌细胞对化疗药ADR、5-FU和CDDP产生耐药,这种调节作用与细胞抗凋亡能力增强相关。体内试验同样证实下调UCA1表达可降低胃癌细胞的化疗敏感性。3.荧光原位杂交和胞浆胞核分离实验证实UCA1主要分布在胞浆,胞核中也有少量分布,提示UCA1主要在转录后水平发挥调节作用。4.Reg RNA、PITA和FINDTAR3数据库预测发现UCA1全长序列包含let-7家族mi RNA结合位点,其中以let-7e结合位点评分最高。Lnc RNAtor数据库预测发现UCA1可与AGO2蛋白结合。RIP实验证实,相对于对照Ig G抗体,抗AGO2抗体可显著富集AGO2-UCA1复合物,表明UCA1可与AGO2蛋白结合。Let-7e可降低UCA1双荧光素酶报告基因的荧光素信号强度,UCA1上let-7e结合位点突变可部分抑制这一效应,表明UCA1可与let-7e直接结合。以上结果表明UCA1可作为竞争内源性RNA,通过结合let-7发挥转录后调节作用。5.HMGA2是let-7已验证的下游靶分子。let-7e在胃癌耐药细胞表达降低,HMGA2在胃癌耐药细胞表达升高。过表达let-7e或干扰HMGA2可降低胃癌耐药细胞对ADR、5-FU和CDDP的IC50,同时化疗药物诱导的细胞凋亡增加。Let-7e可以负向调控HMGA2蛋白表达,证实HMGA2是let-7e的下游靶分子。UCA1可以正向调控HMGA2蛋白表达,相关分析表明二者表达呈正相关。UCA1促进HMGA2表达依赖于结合let-7,let-7结合位点突变可抑制这一效应。【结论】UCA1在胃癌耐药细胞、多种消化系肿瘤细胞及胃癌组织中表达上调,是重要的耐药相关基因和促癌因子。上调UCA1可促进体内、体外胃癌细胞的多药耐药性。UCA1作为竞争内源性RNA,通过结合let-7(尤其是let-7e),降低let-7对耐药相关基因HMGA2的抑制作用,HMGA2表达升高,通过抗凋亡作用促进胃癌细胞的多药耐药性。综上所述,本研究以竞争内源性RNA理论作为桥梁,将胃癌耐药lnc RNA表达谱和mi RNA表达谱数据整合分析,从非编码RNA相互作用角度阐示了UCA1-let-7-HMGA2通路在胃癌多药耐药中的调节作用,可望为逆转胃癌多药耐药提供新的分子靶点。
【关键词】：胃癌 多药耐药 长链非编码RNA 竞争内源性RNA 尿路上皮癌相关转录本1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表5-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-17
• 文献回顾17-36
• 第一部分 长链非编码RNA芯片筛选及UCA1的表达验证36-47
• 引言36
• 1 材料36-37
• 1.1 细胞系36-37
• 1.2 主要试剂37
• 1.3 主要仪器37
• 2 方法37-40
• 2.1 细胞培养37-38
• 2.2 Trizol法提取细胞总RNA38
• 2.3 q RT-PCR验证lnc RNA的表达38-40
• 3 结果40-45
• 4 讨论45-47
• 第二部分 Lnc RNA UCA1对胃癌多药耐药的调节作用47-57
• 引言47
• 1 材料47-49
• 1.1 细胞系47
• 1.2 主要试剂47-49
• 1.3 主要仪器49
• 2 方法49-51
• 2.1 细胞培养49
• 2.2 X-treme GENE转染试剂转染si RNA或质粒49-50
• 2.3 慢病毒稳转细胞系的构建50
• 2.4 q RT-PCR检测UCA1的表达50
• 2.5 MTT法检测细胞体外药物敏感性50
• 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡50-51
• 2.7 裸鼠皮下移植瘤模型观察肿瘤的体内药物敏感性51
• 3 结果51-56
• 3.1 稳定转染细胞系的建立51-52
• 3.2 UCA1对胃癌细胞耐药性的影响52-53
• 3.3 UCA1对胃癌细胞凋亡的调节53-55
• 3.4 体内实验验证UCA1对胃癌细胞耐药的影响55-56
• 4 讨论56-57
• 第三部分 UCA1作为ce RNA促进胃癌耐药的机制研究57-76
• 引言57
• 1 材料57-59
• 1.1 细胞系57
• 1.2 主要试剂57-59
• 1.3 主要仪器59
• 2 方法59-65
• 2.1 原位杂交检测胃癌细胞内UCA1表达59-60
• 2.2 胞核胞浆RNA分离60
• 2.3 细胞mi RNA提取与q RT-PCR检测mi RNA表达60-62
• 2.4 Western blot 检测蛋白表达62
• 2.5 RNA结合蛋白免疫共沉淀（RIP）62-64
• 2.6 双荧光素酶报告基因实验64-65
• 3 结果65-73
• 3.1 UCA1的细胞内定位研究65-67
• 3.2 UCA1与mi RNA、蛋白相互作用的生物信息学预测67-68
• 3.3 UCA1与AGO2、let-7e相互作用的的实验验证68-70
• 3.4 let-7 及HMGA2的表达功能验证和let-7 下游靶分子验证70-72
• 3.5 UCA1与HMGA2的相关分析及UCA1对HMGA2的表达调控验证72-73
• 4 讨论73-76
• 小结76-77
• 参考文献77-90
• 附录90-91
• 个人简历和研究成果91-92
• 致谢92-93

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本文编号：877807