检测前列腺癌细胞PC3溶酶体膜通透化模型—pLamp2C-mRFP-EGFP的构建
发布时间：2017-09-18 23:12
本文关键词：检测前列腺癌细胞PC3溶酶体膜通透化模型—pLamp2C-mRFP-EGFP的构建
【摘要】：目的:利用串联红绿荧光蛋白报告基因标记的溶酶体膜蛋白来检测前列腺癌细胞溶酶体的变化,构建靶向溶酶体膜通透化(LMP)的筛选模型,为后续靶向溶酶体膜通透化的药物筛选奠定基础。方法:1.设计构建串联红绿荧光报告基因标记溶酶体膜蛋白(Lamp2C)的真核表达载体pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C;2.用不同浓度的鞘氨醇处理细胞,利用流式细胞术和MTT观察鞘氨醇对细胞凋亡和坏死的影响;3.荧光显微镜观察构建的质粒转染入PC3细胞的表达情况;用LysoTracker Blue孵育标记转染后的PC3细胞,共聚焦显微镜下观察转染的质粒与溶酶体共定位情况;用鞘氨醇处理转染后的PC3细胞,共聚焦显微镜观察加入鞘氨醇前后红绿荧光的变化。利用Image J软件定量分析共定位情况和红绿荧光变化。结果:1.pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C质粒构建成功;2.鞘氨醇能诱导细胞凋亡;3.四种质粒瞬时转染至PC3细胞,pLamp2C-mRFP-EGFP转染效果最好,mRFP及EGFP均正常表达;pLamp2C-mRFP-EGFP与溶酶体共定位结果:皮尔森相关系数(Pearson’s correlation coefficient)为0.8362±0.0518;经鞘氨醇处理前后,PC3细胞绿色荧光强度(0.1190±0.0223)比(0.0639±0.0156),明显减弱(t=14.66,P㩳0.05),差异有统计学意义,红色荧光强度(0.1049±0.0101)比(0.1038±0.0109),无明显变化(t=1.136,P㧐0.05),差异无统计学意义。结论:成功转染构建的pLamp2C-mRFP-EGFP至PC3细胞溶酶体,经鞘氨醇处理后绿色荧光明显减弱,红色荧光无明显变化,指示PC3细胞溶酶体膜通透化。
【关键词】：溶酶体膜通透化 前列腺癌细胞 鞘氨醇 凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25
【目录】：
- 中文摘要4-5
- Abstract5-10
- 缩略语/符号说明10-11
- 前言11-13
- 研究现状、成果11-12
- 研究目的、方法12-13
- 一、构建串联荧光报告基因pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-Lamp2C13-39
- 1.1 对象和方法13-26
- 1.1.1 实验所需质粒13
- 1.1.2 实验所需主要仪器13-14
- 1.1.3 实验所需主要试剂14
- 1.1.4 主要溶液配制14-15
- 1.1.5 构建串联荧光报告基因pLamp2C-mRFP-EGFP15-21
- 1.1.6 构建串联荧光报告基因pLamp2C-EGFP-mRFP21-23
- 1.1.7 构建串联荧光报告基因pmRFP-EGFP-Lamp2C23-24
- 1.1.8 构建串联荧光报告基因pEGFP-mRFP-Lamp2C24-26
- 1.2 结果26-37
- 1.2.1 pLamp2C-mRFP-EGFP26-29
- 1.2.2 pLamp2C-EGFP-mRFP29-32
- 1.2.3 pmRFP-EGFP-Lamp2C32-34
- 1.2.4 pEGFP-mRFP-Lamp2C34-37
- 1.3 讨论37-38
- 1.4 小结38-39
- 二、鞘氨醇对PC3细胞凋亡和坏死的影响39-48
- 2.1 实验材料39-41
- 2.1.1 研究对象39
- 2.1.2 主要的实验试剂39
- 2.1.3 主要的仪器及实验设备39-40
- 2.1.4 试剂的配制方法40-41
- 2.2 实验方法41-44
- 2.2.1 细胞复苏、培养、传代、冻存41-42
- 2.2.2 细胞计数42
- 2.2.3 流式细胞术检测凋亡42-43
- 2.2.4 MTT法检测细胞坏死43-44
- 2.3 结果44-45
- 2.4 讨论45-46
- 2.5 小结46-48
- 三、溶酶体膜通透化对荧光报告基因红、绿荧光蛋白的影响48-65
- 3.1 实验对象和材料48-50
- 3.1.1 细胞48
- 3.1.2 主要的实验试剂48
- 3.1.3 实验主要仪器设备48-49
- 3.1.4 所需主要试剂及溶液配制49-50
- 3.2 实验方法50-56
- 3.2.1 PC3细胞复苏、培养、传代、冻存50-51
- 3.2.2 提取质粒pLamp2C-mRFP-EGFP、pLamp2C-EGFP-mRFP、pmRFP-EGFP-Lamp2C、pEGFP-mRFP-LAMP2C51-54
- 3.2.3 PC3细胞转染54-55
- 3.2.4 LysoTracker Blue标记溶酶体55
- 3.2.5 利用鞘氨醇诱导溶酶体膜通透化55-56
- 3.2.6 统计学处理56
- 3.3 结果56-61
- 3.3.1 转染PC3细胞56
- 3.3.2 pLamp2C-mRFP-EGFP与溶酶体共定位56-58
- 3.3.3 鞘氨醇处理前后pLamp2C-mRFP-EGFP的红绿荧光变化58-61
- 3.4 讨论61-64
- 3.5 小结64-65
- 结论65-66
- 参考文献66-70
- 发表论文和参加科研情况说明70-71
- 综述 溶酶体膜通透化与细胞死亡的研究进展71-80
- 综述参考文献76-80
- 致谢80-81
- 个人简历81
本文编号：878069
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