IL-17通过抑制MDSCs凋亡影响小鼠抗瘤免疫应答的实验研究

发布时间：2017-09-20 06:00

  本文关键词：IL-17通过抑制MDSCs凋亡影响小鼠抗瘤免疫应答的实验研究

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【摘要】：目的:体外观察白细胞介素17(interleukin17,IL-17)对小鼠髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells)凋亡的影响,并探讨ERK1/2分子在其中的作用;于Lewis荷瘤小鼠体内研究IL-17是否通过调控MDSCs凋亡而影响肿瘤的生长。方法:(1)通过皮下注射Lewis细胞构建荷瘤小鼠模型,采用免疫磁珠分选技术(MACS)分离脾脏MDSCs细胞,常规培养。经IL-17处理后,使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs凋亡情况,通过Western-blot技术检测BCL-2的表达以及ERK1/2的磷酸化水平。(2)在MDSCs培养体系中加入不同浓度ERK1/2分子磷酸化抑制剂(U0126)预处理,再经IL-17作用,运用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs的凋亡情况并通过Western-blot技术检测BCL-2的表达水平。(3)在荷瘤小鼠体内腹腔注射IL-17,2.5μg/只/次,共三次。观察肿瘤生长情况,测量肿瘤重量和大小;通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测核蛋白(Ki67)mRNA、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达情况。采用流式细胞术(FCM)检测树突状细胞、巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例,免疫荧光技术(IF)检测肿瘤组织中MDSCs的浸润情况。(4)IL-17处理荷瘤小鼠后,通过MACS分选出MDSCs细胞。运用Western-blot技术检测细胞中ERK1/2磷酸化水平。常规培养后,使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs的凋亡情况,采用精氨酸酶(ARG-1)试剂盒检测ARG-1活性,运用Western-blot技术检测BCL-2表达水平。(5)IL-17处理荷瘤小鼠后,使用吉西他滨清除荷瘤小鼠体内MDSCs,过继转移经U0126处理后的MDSCs(简称过继转移模型)。测量肿瘤体积、重量,采用qRT-PCR检测肿瘤组织中iNOS mRNA表达水平,通过MACS分选MDSCs,常规培养,使用AnnexinV/PI凋亡试剂盒检测MDSCs凋亡情况,使用ARG-1试剂盒检测ARG-1活性,运用Western-blot技术检测BCL-2表达水平。结果:(1)IL-17处理MDSCs细胞24h,对照组活细胞比例为(45.33±1.556)%,il-17处理组为(59.55±2.831)%(p0.001),晚期凋亡细胞比例对照组为(22.87±1.349)%,il-17处理组为(13.70±1.003)%(p0.01)。western-blot结果显示:il-17处理组erk1/2分子磷酸化水平(p0.001)、bcl-2表达水平都明显上调(p0.01)。(2)在mdscs培养体系中加入erk1/2分子磷酸化抑制剂(u0126)预处理,再加入il-17处理。24h后,当u0126浓度为7.5μm时,空白对照组活细胞比例为(39.08±2.718)%,u0126处理组为(15.57±1.009)%(p0.001),空白对照组晚期凋亡细胞比例为(8.007±1.777)%,u0126处理组为(26.95±1.179)%(p0.01)。western-blot检测发现,u0126处理组抗凋亡蛋白bcl-2表达明显减少。(3)与pbs对照组相比,il-17处理荷瘤小鼠后,肿瘤生长速度加快(p0.01),肿瘤体积增加[pbs组为2.753±0.7803cm3,il-17处理组为6.000±0.8653cm3)(p0.05)],肿瘤重量增加[pbs组为1.886±0.2020g,il-17处理组为3.480±0.4586g(p0.05)],核蛋白ki67mrna表达增加(p0.05)。fcm结果显示:对照组脾脏中mdscs数量为(2.187±0.2541)×107、比例为(13.40±0.3606)%,il-17处理组数量为(3.967±0.1133)×107,比例为(24.43±1.1240)%(p0.001)。if结果显示肿瘤组织中mdscs浸润数目增加,qrt-pcr检测发现肿瘤组织中inosmrna表达增加(p0.05)。(4)与pbs对照组相比,western-blot检测发现经il-17处理后的荷瘤小鼠脾脏mdscs中erk1/2磷酸化水平、bcl-2表达水平明显上调(p0.05);arg-1活性明显增强(p0.05)。体外培养24h后,pbs对照组活细胞比例为(44.23±3.477)%,il-17处理组为(59.33±2.718)%(p0.05);pbs对照组晚期凋亡细胞比例为(33.28±4.104)%,il-17处理组为(19.26±2.494)%(p0.05)。(5)与对照组相比,过继转移经u0126处理的mdscs后,脾脏和肿瘤组织中mdscs分别减少了3.6%(p0.05)、5.3%(p0.01),肿瘤体积减小,肿瘤重量减轻(对照组为2.948±0.7537g,u0126处理组为0.7830±0.1597g)(p0.05),肿瘤组织中ki67mrna(p0.01)、inosmrna的相对表达水平降低(p0.05),脾脏分离出的mdscs经培养后,凋亡水平明显增加,bcl-2表达量明显减少(p0.001)。结论:(1)IL-17在体外能够通过增强ERK1/2分子的磷酸化抑制MDSCs的凋亡(2)IL-17能通过抑制MDSCs的凋亡和增强其免疫抑制活性促进肿瘤的生长。IL-17在荷瘤小鼠体内可明显促进肿瘤生长,这种作用与IL-17抑制MDSCs的凋亡有关。
【关键词】：白细胞介素-17 髓源性抑制性细胞 凋亡 ERK1/2分子
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 绪论14-28
• 1.1 MDSCs(myeloid-derived suppressor cells)14-19
• 1.1.1 MDSCs的来源和分群14-15
• 1.1.2 MDSCs的产生15
• 1.1.3 MDSCs的免疫抑制功能及相关机制15-16
• 1.1.4 MDSCs与其它细胞交叉作用16-17
• 1.1.5 MDSCs与疾病的关系17-19
• 1.2 IL-1719-22
• 1.2.1 IL-17的来源19-20
• 1.2.2 IL-17的调节20-21
• 1.2.3 IL-17与疾病的关系21-22
• 1.3 凋亡22-24
• 1.3.1 凋亡的机制和作用23-24
• 1.3.2 MDSC的凋亡24
• 1.4 本研究的目的、方法、实验设计及意义24-28
• 1.4.1 研究目的24
• 1.4.2 研究方法24-25
• 1.4.3 实验设计25-27
• 1.4.4 实验意义27-28
• 第二章 IL-17在体外对MDSCs凋亡的影响28-41
• 2.1 实验材料28-30
• 2.1.1 实验小鼠28
• 2.1.2 主要试剂28-29
• 2.1.3 主要耗材和仪器29-30
• 2.2 实验方法30-33
• 2.2.1 Lewis荷瘤小鼠模型的建立30
• 2.2.2 小鼠MDSCs分离30-31
• 2.2.3 流式细胞术检测MDSCs凋亡情况31
• 2.2.4 蛋白印迹法检测MDSCs中BCL-2、ERK1/2、p-ERK1/2 的表达情况31-33
• 2.2.5 统计学方法33
• 2.3 实验结果33-40
• 2.3.1 IL-17刺激后MDSCs凋亡的变化33-36
• 2.3.2 IL-17 刺激后 MDSCs 中 BCL-2 表达水平的变化36
• 2.3.3 IL-17刺激MDSCs后ERK1/2 分子表达水平变化36-40
• 2.4 讨论40-41
• 第三章 IL-17在肺癌移植瘤模型中对肿瘤生长和MDSCs数量的影响41-53
• 3.1 实验材料41-42
• 3.1.1 实验小鼠41-42
• 3.1.2 主要试剂42
• 3.1.3 主要仪器42
• 3.2 实验方法42-46
• 3.2.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立42-43
• 3.2.2 IL-17处理小鼠Lewis肺癌移植瘤模型43
• 3.2.3 肿瘤生长的检测、最终体积的测量、肿瘤组织重量的测量43
• 3.2.4 肿瘤细胞中Ki67mRNA的检测43-45
• 3.2.5 流式细胞术检测MDSCs比例45
• 3.2.6 免疫荧光检测MDSCs比例45-46
• 3.2.7 统计学分析46
• 3.3 实验结果46-52
• 3.3.1 肿瘤的发展进程46-47
• 3.3.2 肿瘤大体观察47
• 3.3.3 肿瘤组织的最终体积47-48
• 3.3.4 肿瘤的重量48
• 3.3.5 Ki67mRNA的检测48-49
• 3.3.6 肿瘤组织部位MDSCs变化情况49-52
• 3.4 讨论52-53
• 第四章 IL-17通过抑制MDSCs凋亡促进肿瘤的生长53-60
• 4.1 实验材料53-54
• 4.1.1 实验小鼠53
• 4.1.2 主要试剂53-54
• 4.1.3 实验耗材和仪器54
• 4.2 实验方法54-55
• 4.2.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立54
• 4.2.2 小鼠脾细胞MDSCs分离54-55
• 4.2.3 小鼠脾细胞MDSCs凋亡的检测55
• 4.2.4 蛋白印迹法检测MDSCs中BCL-2、ERK1/2、p-ERK1/2 的表达情况55
• 4.2.5 统计学分析55
• 4.3 实验结果55-58
• 4.3.1 IL-17小鼠体内MDSCs凋亡情况55-57
• 4.3.2 Western-Bot检测MDSCs中BCL-2 和P-ERK1/2、ERK1/2 蛋白的表达情况57-58
• 4.4 讨论58-60
• 第五章 IL-17通过ERK1/2 分子抑制MDSCs凋亡60-69
• 5.1 实验材料60-61
• 5.1.1 实验小鼠60
• 5.1.2 主要试剂60
• 5.1.3 主要耗材和仪器60-61
• 5.2 实验方法61-62
• 5.2.1 小鼠Lewis肺癌移植瘤模型的建立61
• 5.2.2 小鼠脾细胞MDSCs分离61
• 5.2.3 小鼠脾细胞MDSCs凋亡的检测61
• 5.2.4 蛋白印迹法检测MDSCs中BCL-2、ERK1/2、p-ERK1/2 的表达情况61
• 5.2.5 定量PCR检测肿瘤组织中iNOS表达水平61
• 5.2.6 MDSCs的清除61-62
• 5.2.7 过继转移模型的构建62
• 5.2.8 精氨酸酶检测62
• 5.2.9 统计学分析62
• 5.3 实验结果62-67
• 5.3.1 IL-17对ERK1/2 分子抑制后的MDSCs凋亡的影响62-66
• 5.3.2 ERK1/2 分子磷酸化受抑制后的MDSCs对肿瘤生长的影响66-67
• 5.4 讨论67-69
• 第六章 结论与展望69-70
• 6.1 主要结论69
• 6.2 展望69-70
• 参考文献70-79
• 致谢79-80
• 攻读硕士学位期间发表的文章80

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