去泛素化酶对PTEN蛋白稳定性调控的研究

发布时间：2017-09-22 18:26

  本文关键词：去泛素化酶对PTEN蛋白稳定性调控的研究

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【摘要】：PTEN(phosphatase and tension homologue deleted from chromosome 10)的全称是定位在10号染色体上,与张力蛋白同源有缺失的磷酸酶基因。含有403个氨基酸组成的编码蛋白分子,分子量约为56kDa。PTEN蛋白主要包括3个结构功能区,一个氨基端磷酸酶区,一个与脂质结合的C2区和由约50个氨基酸组成的羧基末端,在细胞中表现出蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶的双重特异性磷酸酶活性,是目前为止发现的首个磷酸酶活性的抑癌基因。它的主要功能是特异性地使磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)第3位磷酸基团去磷酸化,从而拮抗PI3K激酶的功能,进而抑制PI3K下游特别是PI3K-AKT这条通路的信号转导,发挥着抑制细胞生长、侵袭、增殖和迁移等多种生物学效应。实验研究发现近年来在多种肿瘤中存在PTEN的缺失或突变,纯合缺失PTEN基因的小鼠胚胎致死,杂合缺失PTEN基因的小鼠则自发形成多种类型的肿瘤,证明PTEN确实在体内具有抑癌基因的功能。鉴于PTEN的重要性,其活性与稳定性必然受到严谨的调控,理论上讲,蛋白稳定性及蛋白量的控制,除了受到转录水平及蛋白合成的影响外,非常重要的一种机制就是泛素化降解与去泛素化稳定的体内平衡调控。泛素连接酶促进底物泛素化修饰而降解；相反,去泛素化酶可以去除底物的泛素化,阻断蛋白酶体介导的降解,保护底物蛋白使其水平上调。考虑到泛素化酶与去泛素化酶对维持PTEN蛋白半衰期调控的重要性,促进PTEN泛素化的E3在调节PTEN半衰期中具有重要的功能。相反,抑制PTEN去泛素化修饰、阻断蛋白酶体降解的DUB在调节PTEN半衰期中具有相对更为重要的角色。已报道促进PTEN泛素化的E3有NEDD4-1、WWP2、CHIP、XIAP和 TRIM27/RFP,而促进其去泛素化的DUB报道有HAUSP/USP7和USP13,HAUSP/USP7去除的是PTEN的单泛素化,促使PTEN从细胞核转移到细胞质,但并不影响PTEN的蛋白稳定性和蛋白量。USP13能够在细胞质中稳定PTEN的蛋白水平,去除PTEN的多聚泛素化链之间的连接,保护PTEN免受蛋白酶体的降解。既然PTEN在体内受到泛素化酶和去泛素化酶的平衡调控,那么相应的调控PTEN蛋白稳定性的去泛素化酶也不止一个,前期我们在实验中发现USP10和PTEN存在相互作用,之前报道USP10可以在细胞质中拮抗MDM2对p53的降解作用,稳定p53的蛋白水平,进而抑制细胞的增殖,侵袭等发挥重要的抑癌功能。另有研究发现p53可以影响PTEN的转录活性,而PTEN反过来也可以影响p53的蛋白活性,那么USP10是否也可以对PTEN发挥重要的作用并没有报道,因此围绕两者的相互关系展开以下的实验研究：1、通过内源IP实验和体外GST pull-down实验证明USP10和PTEN存在相互作用,在缺失p53的结直肠癌细胞HCT116也能检测到两者存在相互作用,说明USP10对PTEN的调控作用不依赖p53的调控。2、间接免疫荧光实验证明两者共同定位在细胞质中,对细胞进行核质分离后同样证明USP10主要维持细胞质中的PTEN蛋白水平。3、蛋白稳定实验证明过表达USP10后可以延长PTEN蛋白的半衰期,敲低USP10蛋白能够缩短PTEN的半衰期。4、内源泛素化实验证明过表达USP10可以减弱PTEN的泛素化,同样在敲低USP10的细胞中检测到PTEN的泛素化增强,说明USP10影响PTEN的稳定性是通过蛋白酶体调控的。5、以USP13为阳性对照,发现敲低USP10, USP13后两者对PTEN以及PI3K-AKT通路有相同的负向调控作用。6、USP10影响细胞的增殖速度,不影响细胞凋亡功能。因此总的来看USP10能够维持PTEN的蛋白稳定性、维持细胞PTEN适量蛋白水平及调节细胞增殖与稳态中具有重要的功能,它可以特异性地去除PTEN的泛素链,拮抗PTEN的降解,推测USP10很可能通过维持PTEN蛋白水平来发挥抑癌功能。
【关键词】：PTEN USP10 多聚泛素化 蛋白酶体
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 缩略语5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 材料与方法13-22
• 结果22-30
• 讨论30-32
• 结论32-33
• 其他工作33-36
• 参考文献36-39
• 附录1：主要仪器设备39-40
• 附录2：PCR引物序列40-41
• 附录3：在读期间发表的代表性论文41-46
• 附录4：个人简历46-47
• 致谢47-48
• 综述48-58
• 参考文献55-58

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本文编号：902378