肿瘤微环境中hUC-MSCs的生物学特性分析

发布时间：2017-09-22 19:04

  本文关键词：肿瘤微环境中hUC-MSCs的生物学特性分析

  更多相关文章： hUC-MSCS 肿瘤微环境 生物学特性 BMSCS

【摘要】：目的通过构建人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)与MCF-7B乳腺癌细胞及U251脑胶质瘤细胞非接触共培养模型,探讨hUC-MSCs在肿瘤微环境中生物学特性改变及其分子机制,为hUC-MSCs作为肿瘤靶向治疗载体的临床安全应用提供前期实验基础；通过构建SD大鼠脑胶质瘤模型,肿瘤原位注射BMSCsCM-Dil (Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)并动态观察其在肿瘤组织的分布,为BMSCs在体内脑胶质瘤微环境中恶性转化的研究提供实验模型。材料与方法1.实验动物SPF级雄性裸鼠,6周龄,体重20±5g；SPF级雄性SD大鼠,3-5周龄,体重50±10 g；SPF级雄性SD大鼠,体重200-250 g；以上实验动物购于“重庆医科大学实验动物中心”。2.细胞来源hUC-MSCs由重庆市干细胞治疗工程技术研究中心惠赠；乳腺癌细胞系MCF-7B购自广州吉妮欧生物科技有限公司；脑胶质瘤细胞系U251购自中国科学院上海细胞库；脑胶质瘤细胞系C6来源于重庆医科大学“儿科研究所”；大鼠BMSCs由骨髓贴壁法分离获得。3.实验分组研究共分为三部分：4.实验方法第一部分及第二部分：hUC-MSCs在肿瘤微环境中生物学特性的检测4.1非接触共培养后,细胞形态学特征观察。4.2流式细胞术检测细胞周期时相分布。4.3 CCK-8检测细胞增殖能力。4.4细胞染色体核型分析。4.5体内裸鼠成瘤试验及组织HE染色。4.6β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。4.7 RT-qPCR检测各组hTERT.c-Myc和Bcl-x1的mRNA相对表达.4.8 Western b lot检测各组p53.c-Myc和Bcl-x1蛋白表达。4.9细胞免疫荧光检测c-Myc和Bcl-xl蛋白表达及定位。第三部分：脑胶质瘤模型建立及BMSCsCM-Dil原位注射及其分布观察4.10倒置显微镜下观察CM-Dil荧光标记的BMSCs。4.11脑活体定位建立脑胶质瘤模型。4.12 HE染色观察脑胶质瘤组织结构。4.13荧光显微镜下观察BMSCs在肿瘤组织中的分布。结果第一部分及第二部分：hUC-MSCs在肿瘤微环境中的生物学特性分析1.各组细胞培养至P10代,两实验组hUC-MSCs呈多形性,大小不均核质比略增大,细胞聚集成团状生长,排列较紊乱呈轻度异型性。2.实验组1和实验组2的hUC-MSCs G1期比例显著低于对照组(p0.05),S期和G2期细胞比例均显著高于对照组(p0.05)。3.两实验组细胞增殖率在第2天到第6天均显著高于空白对照组的hUC-MSCs (p0.05)。4.两实验组经染色体分析,其染色体总数均为46条,分为23对(46,XX),G显带未见染色体结构出现明显异常的改变。5.8W后空白对照组及两实验组裸鼠死亡未见包块形成。HE染色显示,空白对照组及两实验组皮下肌肉组织结构正常,排列规则,细胞胞质染为红色,多个扁平胞核分布于细胞边缘,呈蓝色。6.培养至6Wβ-半乳糖苷酶染色显示,实验组1与实验组2 SA-P-gal活性细胞比例显著高于空白对照组(p0.05)。7.实验组1和实验组2细胞c-Myc和Bcl-xl的mRNA相对表达量与空白对照组相比均显著增高,差异有统计学意义(p0.05),而实验组hTERT mRNA水平与空白对照组比较无显著差异,且较阳性对照组,其表达量极低。8.实验组1和实验组2细胞p53、c-Myc和Bcl-xl蛋白相对表达量均显著高于空白对照组,差别有统计学意义(p0.05)。9.c-Myc蛋白定位于细胞核,两实验组阳性率均显著高于空白对照组(p0.05)；Bcl-xl胞质与胞核均有表达,主要定位于细胞核外膜,两实验组阳性表达率均显著高于空白对照组(p0.05)。第三部分：脑胶质瘤模型建立及BMSCsCM-Dil原位注射及分布观察10.CM-Dil标记的BMSCs呈现红色荧光,主要表达于细胞膜。11.脑胶质瘤模型建立后7 d, SD大鼠右侧大脑半球表面出现直径约1 cm的圆形异常组织,浸润生长,周边组织肿胀,中线向左侧偏移约1-1.5 mm。12.HE染色可见肿瘤组织密集排列,浸润性生长,与正常脑部组织分界不清,质地较均匀,炎症细胞浸润,胞核深染,核质比增大,亦可见新生血管生成。13.实验组BMSCsCM-Dil植入C6/SD大鼠脑胶质瘤中2 d,存在于针道损伤部位,7d后BMSCsCM-Dil已大量迁移至肿瘤组织边缘。结论1.本研究通过hUC-MSCs与MCF-7B乳腺癌细胞及U251脑胶质瘤细胞非接触共培养模型的构建,证实hUC-MSCs受肿瘤微环境中炎症性因子作用易通过细胞周期限制点使增殖能力加强,受癌基因压力信号作用,p53蛋白激活致使不可修复的细胞衰老,防止其恶性转化,维持细胞基因组的稳定性,2.成功构建SD大鼠C6脑胶质瘤脑内模型,CM-Dil荧光标记的BMSCs植入胶质瘤内定位分布于正常脑组织与胶质瘤的交界部位,为BMSCs在体内脑胶质瘤微环境中恶性转化的研究提供实验模型。
【关键词】：hUC-MSCS 肿瘤微环境 生物学特性 BMSCS
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-17
• 前言17-19
• 第一部分 肿瘤微环境中hUC-MSCs的生物学特性19-33
• 1 材料与方法19-24
• 2 结果24-28
• 3 讨论28-30
• 4 结论30-31
• 参考文献31-33
• 第二部分 hUC-MSCs在肿瘤微环境中生物学特性改变的分子机制研究33-47
• 1 材料与方法33-39
• 2 结果39-41
• 3 讨论41-44
• 4 结论44-45
• 参考文献45-47
• 第三部分 SD大鼠C6脑胶质瘤脑内模型的建立及大鼠BMSCs原位注射后的分布观察47-57
• 1 材料与方法47-51
• 2 结果51-53
• 3 讨论53-54
• 4 结论54-55
• 参考文献55-57
• 全文总结57
• 创新性与意义57
• 局限性57-58
• 文献综述58-66
• 参考文献63-66
• 致谢66-67
• 攻读硕士学位期间发表学术论文目录67

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本文编号：902523