沉默NMHC Ⅱ不同亚型基因对乳腺癌体内外生物学行为的影响

发布时间：2017-09-23 04:41

  本文关键词：沉默NMHC Ⅱ不同亚型基因对乳腺癌体内外生物学行为的影响

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【摘要】：乳腺癌是危害女性健康的恶性肿瘤之一，肿瘤转移是恶性肿瘤的主要特征，肿瘤的转移和复发是治愈乳腺癌的最大障碍，也是乳腺癌患者死亡的主要原因。研究发现，肿瘤的侵袭转移与迁移蛋白的调节有关，而非肌细胞肌球蛋白作为马达蛋白家族成员在细胞运动调节中起关键作用，因此，非肌细胞肌球蛋白在肿瘤转移中的作用已经引起研究者们的关注。 非肌细胞肌球蛋白Ⅱ（Nonmuscle Myosin Ⅱ,NMⅡ）是细胞骨架的重要组成成分，，也是马达蛋白超家族的成员，不仅为细胞内分子运动提供动力，也参与细胞内各种生理活动。肿瘤转移的起始阶段包括细胞的极化、粘附改变、细胞迁移。而NMⅡ不仅参与细胞运动，也是细胞极化和细胞粘附的重要调节器，因此，我们推测，NMⅡ参与肿瘤转移的调节。NMⅡ由两条230KD的重链（Nonmuscle Myosin Heavy Chain），一对20KD的调节轻链（Regulatory LightChain, RLC），和一对17KD的关键轻链（Essential Light Chain, ELC）组成。在细胞运动过程中，轻链起稳定和调节作用，重链与肌动蛋白结合直接调节细胞运动力。根据重链不同，NMHCⅡ可分为NMHCⅡA，NMHCⅡB和NMHCⅡC三种亚型，分别由MYH9，MYH10和MYH14基因编码。 在前期工作中，我们在乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7细胞中，均检测到NMHCⅡA和NMHCⅡB两个亚型，未检测到NMHCⅡC；NMHCⅡA、B两个亚型在乳腺癌组织和细胞中的表达均高于它们在正常乳腺组织和细胞中的表达；且淋巴结转移组表达明显增高。因此，我们认为NMHCⅡ与乳腺癌的恶性程度及转移密切相关。 目的： 利用RNAi干扰技术，建立稳定沉默NMHCⅡ不同亚型的细胞株，通过体外实验及NOD/SCID小鼠体内移植瘤模型研究沉默不同亚型的细胞对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响。 方法： 1.采用RNAi技术分别沉默MCF-7细胞的NMHCⅡA、NMHCⅡB基因，并筛选出各自的稳定细胞株。筛选出的稳定细胞株作为RNAi实验组，以空载质粒组和未转染MCF-7细胞组作为对照组。并利用Western Blot和免疫细胞化学技术检测沉默效率。 2.通过体外实验研究沉默NMHCⅡ不同亚型基因对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响。 （1）应用CCK-8试剂盒检测不同NMHCⅡ基因对MCF-7细胞增殖的影响。 （2）通过流式细胞仪检测沉默各亚型后，细胞周期的变化。 （3）通过细胞划痕实验检测细胞迁移能力的改变。 （4）利用Boyden小室体外侵袭试验检测不同NMHCⅡ亚型对MCF-7细胞侵袭能力的影响。 3.通过构建NOD/SCID小鼠自发转移动物模型，体内实验验证确已沉默NMHCⅡ亚型，并观察NMHCⅡ不同亚型对肿瘤生长转移的影响。 （1）通过免疫组织化学染色观察肿瘤内NMHCⅡA、NMHCⅡB的表达情况。 （2）通过肿瘤大体、组织学观察NMHCⅡ不同亚型缺失对NOD/SCID小鼠成瘤的影响。 （3）通过PCNA、Caspase-3、MMP2免疫组织化学染色，检测NMHCⅡ对NOD/SCID小鼠肿瘤组织增殖、凋亡、侵袭能力的影响。 （4）通过各脏器的观察，检测是否有远处转移。 结果： 1.得到稳定转染的细胞株，通过Western Blot和免疫细胞化学技术染色鉴定转染结果发现，RNAiⅡB组与对照组相比，NMHCⅡB表达明显下降，NMHCⅡA的表达无影响；RNAiⅡA组与对照组相比，NMHCⅡA表达下降，同时NMHCⅡB的表达也明显下调。 2.体外实验结果显示： （1）CCK-8试剂盒检测结果和流式细胞仪检测周期结果均显示，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB均可导致细胞增殖能力的下降。 （2）细胞划痕实验结果表明，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB后，细胞迁移率略快于对照组，但各组间表达无差异。 （3）Boyden小室侵袭实验结果显示，沉默NMHCⅡA和NMHCⅡB后，细胞穿过人工基底膜的细胞少于对照组，但RNAiⅡA与RNAiⅡB两组间表达无差异。 3.通过NOD/SCID小鼠自发转移动物模型体内实验结果显示，确已沉默NMHCⅡ亚型，NMHCⅡA、ⅡB沉默组小鼠肿瘤坏死严重，小鼠肿瘤组织PCNA表达均弱于对照组，Caspase-3表达均强于对照组，MMP2的表达弱于对照组。体内实验各组均无明显转移。 结论： 1.NMHCⅡA与NMHCⅡB之间存在调控关系，NMHCⅡA影响NMHCⅡB的表达。 2.NMHCⅡA和NMHCⅡB对MCF-7细胞的增殖和侵袭有调节作用。 3.缺失NMHCⅡ的MCF-7细胞在NOD/SCID鼠中所形成的肿瘤坏死明显，可能与NMHCⅡ的缺失抑制增殖、促进凋亡有关。
【关键词】：非肌细胞肌球蛋白Ⅱ 肿瘤转移 乳腺癌
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 英文缩略词11-15
• 第1章 文献综述15-26
• 1.1 乳腺癌概况15-16
• 1.2 非肌细胞肌球蛋白Ⅱ概述16-21
• 1.2.1 结构与功能16-17
• 1.2.2 分型17-18
• 1.2.3 NMⅡ与细胞运动的关系18-21
• 1.3 NMⅡ与肿瘤的关系21-26
• 1.3.1 NMⅡ与肿瘤转移的关系21-22
• 1.3.2 NMⅡ对肿瘤转移的调节22-24
• 1.3.3 NMHCⅡ在肿瘤中的作用24-26
• 第2章 实验材料与方法26-38
• 2.1 实验材料26-30
• 2.1.1 细胞系26
• 2.1.2 实验动物26
• 2.1.3 质粒和菌株26
• 2.1.4 主要试剂26-27
• 2.1.5 主要仪器27-28
• 2.1.6 主要试剂的配制28-30
• 2.2 实验方法30-37
• 2.2.1 质粒载体的构建30
• 2.2.2 细胞转染和克隆筛选30-31
• 2.2.3 Western Blot31-33
• 2.2.4 免疫细胞化学染色33-34
• 2.2.5 CCK-8 法绘制生长曲线34
• 2.2.6 细胞周期检测34-35
• 2.2.7 细胞划痕法35
• 2.2.8 Boyden 小室体外侵袭实验35-36
• 2.2.9 NOD/SCID 鼠体内荷瘤模型建立36
• 2.2.10 组织石蜡切片 HE 染色、免疫组织化学染色36-37
• 2.3 统计学分析37-38
• 第3章 结果38-56
• 3.1 稳定转染细胞克隆的筛选及鉴定38-41
• 3.1.1 稳定转染细胞株的建立38
• 3.1.2 稳定转染细胞株的鉴定38-41
• 3.2 体外实验检测沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞生物学行为的影响41-45
• 3.2.1 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞增殖的影响41-43
• 3.2.2 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞迁移的影响43-44
• 3.2.3 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞侵袭的影响44-45
• 3.3 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞体内成瘤能力的影响45-49
• 3.3.1 NOD/SCID 小鼠体内荷瘤动物模型的建立45-47
• 3.3.2 检测 NOD/SCID 小鼠肿瘤组织中 NMHCⅡ亚型的表达47-49
• 3.4 体内实验检测沉默NMHCⅡ各亚型对MCF-7细胞生物学行为的影响49-56
• 3.4.1 免疫细胞化学检测沉默NMHCⅡ对NOD/SCID小鼠肿瘤组织增殖能力的影响49-51
• 3.4.2 免疫细胞化学检测沉默NMHCⅡ对NOD/SCID小鼠肿瘤组织凋亡能力的影响51-53
• 3.4.3 免疫细胞化学检测沉默NMHCⅡ对NOD/SCID小鼠肿瘤组织转移能力的影响53-56
• 第4章 讨论56-62
• 4.1 RNAi 干扰稳定下调 MCF-7 细胞中 NMHCⅡ各亚型的表达56-57
• 4.2 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞生物学行为的影响57-60
• 4.2.1 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞增殖和凋亡的影响57-58
• 4.2.2 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞迁移和侵袭的影响58-60
• 4.3 沉默 NMHCⅡ各亚型对 MCF-7 细胞体内成瘤能力的影响60-62
• 第5章 结论62-63
• 参考文献63-71
• 作者简介及在学期间所获得的科研成果71-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 罗年安;屈亚琦;董瑞;;乳腺癌的治疗进展[J];现代生物医学进展;2015年01期

2 高凤霞;;乳腺癌转移的相关因素研究进展综述[J];医学信息(中旬刊);2011年01期

3 杨景明;邓为民;;保乳术后复发性乳腺癌的治疗进展[J];医学综述;2011年15期

本文编号：903271