MANF对肝癌细胞恶性生物学行为的抑制作用

发布时间：2017-09-23 07:38

  本文关键词：MANF对肝癌细胞恶性生物学行为的抑制作用

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【摘要】：肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是最常见的一种肝癌分型,是我国最常见的恶性肿瘤之一,病因复杂。尽管早期的诊断与治疗有了显著的提高,但由于缺乏适当的治疗措施,肝癌病人的生存率仍然微乎其微。肝癌通常是在慢性炎症的基础上由纤维化发展而来。内质网(endoplasmic reticulum,ER)应激是在蛋白未折叠或者错误折叠时,激活未折叠蛋白反应(unfold protein response,UPR),减少细胞内的异常蛋白的堆积,从而保护细胞的一种真核细胞的保护性应激反应。已有研究表明,有很多的疾病的形成与发展均与ERS密切相关。中脑星形细胞来源的神经生长因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor,MANF)是一个ER应激敏感蛋白,ER应激能上调其表达。本实验室早期研究中发现:在蛋白水平和m RNA水平,肝癌组织的MANF表达均高于癌旁组织,故推测,MANF可能在肝癌中起着重要的作用。因此,本文拟探究MANF对肝癌细胞的恶性生物学行为的影响。目的观察MANF对肝癌细胞的体外增殖、迁移、侵润及体内成瘤的抑制作用。方法收集肝癌病人组织样本,采用免疫组化方法观察MANF蛋白在肝癌和癌旁组织中表达的差异;构建稳定的敲低MANF的肝癌细胞株,然后用MTT法、划痕法、Transwell、软克隆形成实验分别观察敲低MANF对肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭以及单个细胞恶性增殖能力的影响;裸鼠成瘤实验检测MANF对肿瘤增长过程的影响。结果1.观察MANF在HCC样本中的表达对收集的HCC病人肝组织进行免疫组化染色发现,在癌旁组织MANF蛋白表达上调,而癌组织MANF蛋白表达低于癌旁组织。使用原位杂交的方法检测MANF的m RNA时发现,HCC病人肝癌组织MANF表达低于其自身癌旁组织。上述结果提示,在肝癌MANF的转录及翻译是被抑制的。2.MANF对肝癌细胞增殖的影响构建稳定敲低MANF的肝癌细胞株及转染对照载体的细胞株,利用MTT的方法检测细胞增殖的活性。结果发现敲低MANF的肝癌细胞增殖率高于其载体对照,这一结果提示,MANF可以抑制肝癌细胞的增殖。3.MANF对肝癌细胞迁移能力的影响使用已构建的稳定敲低MANF的肝癌细胞株与其对照细胞株,利用划痕实验方法检测MANF对肝癌细胞迁移能力的影响。结果发现敲低MANF的肝癌细胞迁移能力高于其对照组细胞株,这一结果提示,MANF可以抑制肝癌细胞的迁移能力。4.MANF对肝癌细胞侵袭的影响使用已构建的稳定敲低MANF的肝癌细胞株与其对照细胞株,利用Transwell的方法检测MANF对肝癌细胞侵袭能力的影响。结果发现敲低MANF的肝癌细胞侵袭率高于其对照组,该结果提示,MANF可以抑制肝癌细胞的侵袭。5.MANF对肝癌细胞恶性克隆能力的影响使用已构建的稳定敲低MANF的肝癌细胞株与其对照细胞株,利用平板克隆形成实验与软克隆琼脂形成实验方法检测MANF对肝癌细胞恶性克隆能力的影响。结果发现敲低MANF的肝癌细胞恶性克隆能力高于其对照组细胞株,这一结果提示,MANF可以抑制肝癌细胞的恶性克隆形成。6.MANF对裸鼠成瘤的影响在裸鼠成瘤实验中,我们从南京模式动物研究所购买了4-6周的雌性裸鼠,经适应性培养后,随机分为两组,一组皮下注射了稳定敲低MANF的肝癌细胞,另一组注射未敲低MANF的对照的肝癌细胞。结果发现,注射敲低MANF肝癌细胞的裸鼠皮下肿瘤大于注射未敲低MANF肝癌细胞的裸鼠肿瘤。在裸鼠成瘤后,我们对皮下注射了稳定敲低MANF的肝癌细胞的裸鼠再给予尾静脉注射MANF与其对照PBS治疗。结果发现,注射MANF治疗的裸鼠肿瘤小于注射PBS的裸鼠肿瘤。这一结果提示,MANF可以抑制裸鼠肿瘤的生长。结论:1.MANF在HCC中的表达下调;2.MANF可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭以及单个细胞恶性增殖能力;3.MANF可以抑制裸鼠移植瘤的生长。
【关键词】：肝细胞肝癌 神经营养因子 内质网应激 肿瘤恶性生物学行为
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 英文缩略词表(Abbreviation)6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 1 前言15-16
• 2 实验材料16-20
• 2.1 标本制备16
• 2.2 实验动物16
• 2.3 细胞株16
• 2.4 质粒16
• 2.5 抗体16-17
• 2.6 引物17
• 2.7 主要试剂17-19
• 2.8 实验仪器19-20
• 3 实验方法20-33
• 3.1 免疫组织化学20-21
• 3.2 MTT21
• 3.3 Transwell侵袭21-22
• 3.4 划痕22
• 3.5 软琼脂克隆形成实验22-23
• 3.6 平板克隆形成实验23
• 3.7 重组人MANF蛋白的制备23-28
• 3.8 慢病毒感染构建稳定表达株28-29
• 3.9 裸鼠成瘤实验29-30
• 3.10 免疫印迹(Western blot)30-32
• 3.11 HE染色32-33
• 3.12 结果分析33
• 4 结果33-43
• 4.1 观察MANF在HCC组织中的表达水平..33-34
• 4.2 沉默MANF对肝癌细胞的增殖有促进作用34
• 4.3 MANF可以抑制肝癌细胞的迁移34-36
• 4.4 MANF可以抑制肝癌细胞的侵袭36-37
• 4.5 MANF可以抑制肝癌细胞的恶性增殖37-39
• 4.6 构建稳定敲低MANF的肝癌细胞株39-40
• 4.7 MANF蛋白的诱导及纯化40
• 4.8 MANF抑制裸鼠成瘤的影响40-43
• 5 讨论43-44
• 6 结论44-45
• 参考文献45-48
• 附录48-49
• 致谢49-51
• 综述51-56
• 参考文献55-56

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本文编号：904032