肝细胞癌HepG2中p53调控microRNA的表达谱构建和调控网络分析

发布时间：2017-09-24 21:31

  本文关键词：肝细胞癌HepG2中p53调控microRNA的表达谱构建和调控网络分析

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【摘要】：p53作为肿瘤抑制关键转录因子(Transcription Factor, TF),在DNA损伤等细胞压力下被激活并介导参与多种肿瘤相关生物学过程,如细胞周期调控、细胞增殖、细胞凋亡、细胞侵袭和迁移等。作为肿瘤抑制因子,野生型p53蛋白通过转录激活或抑制下游与肿瘤相关基因表达,抑制肿瘤的发生发展过程。MicroRNA(miRNA)是一类由21-24个核苷酸组成的内源性小非编码RNA,最近研究已证实miRNA可受p53蛋白直接调控并参与到多个p53调控网络之中。然而,目前在肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)中p53调控miRNA表达谱以及p53-miRNA参与的调控网络尚不清楚。本文利用抗癌药物阿霉素(Doxorubicin, Dox)诱导HepG2细胞DNA损伤,激活p53信号通路。通过小RNA测序(Small RNA sequencing, small RNA-seq)检测阿霉素处理肝癌细胞HepG2前后miRNA的差异表达情况,利用Targetscan、miRanda和’Tarbase软件对miRNA靶基因进行预测,并使用GO与KEGG通路富集方法对差异表达miRNA靶基因进行功能富集分析。随后通过整合分析p53 ChIP-seq与miRNA转录起始位点(Transcription start site, TSS)数据,识别miRNA转录起始位点上游10kb和下游1 kb假定启动子区域是否存在p53蛋白结合位点,筛选出潜在受p53直接调控的miRNAs。最后选择感兴趣并在肝细胞癌中未曾报道的差异表达miRNA进行测序验证,通过qRT-PCR方法检测p53-miRNA表达变化,并利用CCK-8 (Cell Counting Kit-8)检测miRNA对肝癌细胞增殖的影响。结果显示在阿霉素诱导的DNA损伤条件下,HepG2细胞中p53蛋白表达显著上调。经过两次生物学重复小RNA测序,共筛选出33条显著差异表达miRNAs,其中12条miRNAs上调,21条miRNAs表达下调。MiR2Disease疾病功能分析发现其中有8条miRNAs与肝癌细胞的发生发展过程相关。GO和KEGG通路富集分析结果显示87.6%和90.9% miRNAs的靶基因分别参与到p53介导的细胞进程与信号通路中。MiRNA启动子区p53结合位点分析显示,33条显著差异表达miRNAs中有18条miRNAs具备p53蛋白潜在结合位点,其中有7条miRNAs的启动子区域含有多个p53蛋白结合位点,这意味着这些miRNA可能受p53的直接调控。通过qRT-PCR验证肝细胞癌中未曾报道的差异表达miR-3661和miR-4521,结果显示miR-3661表达量上调10.17倍,miR-4521表达量下调6.25倍,与测序结果趋势一致。随后探讨了p53诱导显著上调的miR-3661对HepG2增殖的影响,发现HepG2细胞中过表达miR-3661抑制HepG2细胞的增殖,抑制率为25.7%(P0.01)。最后构建和分析肝癌细胞HepG2在癌症通路(Pathways in cancer)的p53-miRNA调控网络,并对网络中64条p53-miRNA-mRNA前反馈回路进行了分析。
【关键词】：p53 microRNA 小RNA测序 肝细胞癌 调控网络
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要6-8
• abstract8-12
• 第1章 绪论12-23
• 1.1 p53与肿瘤12-15
• 1.1.1 p53结构与功能12-14
• 1.1.2 p53与DNA损伤14
• 1.1.3 p53介导的肿瘤相关生物进程和信号通路14-15
• 1.2 MicroRNA与肿瘤15-18
• 1.2.1 miRNA生物学合成与作用机制15-17
• 1.2.2 miRNA生物学功能17
• 1.2.3 miRNA与肿瘤17-18
• 1.3 p53与microRNA调控网络18-20
• 1.3.1 p53-microRNA调控18-19
• 1.3.2 p53-microRNA网络研究进展19-20
• 1.4 课题研究目的、意义和内容20-23
• 1.4.1 本课题的研究目的和意义20
• 1.4.2 本课题的研究内容20-22
• 1.4.3 本课题创新点22-23
• 第2章 肝癌细胞中DNA损伤诱导下p53调控microRNA的高通量筛选23-48
• 2.1 材料与方法23-32
• 2.1.1 细胞培养与阿霉素药物处理23-25
• 2.1.2 mRNA水平检测DNA损伤应激条件下p53与p21表达变化25-28
• 2.1.3 蛋白水平检测DNA损伤应激条件下p53表达情况28-30
• 2.1.4 小RNA测序样品的制备30-31
• 2.1.5 sRNA文库构建与测序数据分析31-32
• 2.1.6 差异表达miRNA筛选32
• 2.1.7 miRNA的疾病功能分析32
• 2.2 结果与分析32-46
• 2.2.1 DNA损伤应激条件下p53与下游靶基因表达活化32-37
• 2.2.2 小RNA测序样本总RNA纯度及完整性鉴定37-38
• 2.2.3 小RNA长度分布、碱基偏好性和染色体分布特征38-41
• 2.2.4 HepG2细胞中受p53调控的差异表达miRNA筛选41-44
• 2.2.5 mir2disease介导的疾病功能分析44-46
• 2.3 讨论46-47
• 2.4 本章小结47-48
• 第3章 p53调控差异表达miRNA靶基因预测与功能分析48-66
• 3.1 材料与方法48-52
• 3.1.1 miRNA靶基因预测48
• 3.1.2 Gene Ontology和KEGG通路富集分析48-49
• 3.1.3 p53结合位点ChIP-seq数据分析49
• 3.1.4 p53-miRNA-mRNA调控网络构建49
• 3.1.5 差异表达miRNA的qRT-PCR验证49-51
• 3.1.6 miR-3661对肝癌细胞HepG2增殖的影响51-52
• 3.2 结果与分析52-64
• 3.2.1 miRNA靶基因预测结果52
• 3.2.2 GO功能注释结果52-54
• 3.2.3 KEGG信号通路富集分析结果54-56
• 3.2.4 p53-miRNA结合位点识别56-58
• 3.2.5 p53-miRNA-mRNA调控网络构建58-60
• 3.2.6 差异表达miRNA qRT-PCR验证结果60-62
• 3.2.7 miR-3661抑制HepG2细胞增殖62-64
• 3.3 讨论64-65
• 3.4 本章小结65-66
• 结论66-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-77
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文77

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本文编号：913576