miR-199a通过靶向调控DDR1的表达抑制小鼠乳腺癌细胞4T-1的转移

发布时间：2017-09-25 14:36

  本文关键词：miR-199a通过靶向调控DDR1的表达抑制小鼠乳腺癌细胞4T-1的转移

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【摘要】：乳腺癌是女性高发肿瘤类型,紧随肺癌之后,严重威胁女性健康。其发病机制十分复杂,但根本原因在于遗传基因的改变,其中包括癌基因的过度活化和抑癌基因功能的抑制。乳腺癌的发生、生长、侵袭与转移等发展阶段都存在相应的遗传基因改变,都受到基因的调节。乳腺癌的主要致死原因在于其向脑部、肺部、肝脏及骨骼等部位的远处转移,因此研究乳腺癌的转移机制对乳腺癌治疗具有重要意义。当今,乳腺癌的临床治疗方法主要有:手术疗法、化学药物疗法、内分泌疗法以及生物分子靶向疗法。虽然化学药物治疗在一定程度上提高了乳腺癌患者的生存率,但是药物抵抗的频繁出现使得肿瘤治疗困难重重。因此,生物分子靶向治疗应运而生,开启了乳腺癌治疗的新篇章。探索乳腺癌发生、生长、侵袭与转移等发展阶段的分子机制,寻找新的生物分子治疗靶点成为研究乳腺癌的重中之重。mi R-199家族包括mi R-199-a1,mi R-199-a2和mi R-199b三个成员。mi R-199a有两个成熟序列:mi R-199a-5p和mi R-199a-3p,分别位于人的19号染色体(mi R-199-a1)和1号染色体(mi R-199-a2)上。研究表明mi R-199a在肿瘤细胞中存在过量表达或者表达量下调现象,提示mi R-199a可以通过调控下游癌基因或者抑癌基因参与调控肿瘤的发生发展过程。DDR(discoidin domain receptor)家族包括2个成员:DDR1和DDR2,DDR2只有一个亚型,DDR1则分为5个亚型(DDR1a-DDR1e)。DDR1a、DDR1b和DDR1c是具有活性的DDR1亚型,其中DDR1c是最长的DDR1亚型。DDR1d和DDR1e没有激酶活性。DDR1在人和小鼠的很多组织中表达,尤其是脑部、肺部、肾脏和脾脏。研究表明DDR1通过调节肿瘤细胞与胶原的相互作用在肿瘤发生发展过程中发挥作用。DDR1在很多类型的肿瘤细胞中表达量上调,如:乳腺癌、肺癌、脑癌、肝癌、淋巴瘤等。这一表达的失调和功能的改变与肿瘤的发展过程和肿瘤病人的预后不良密切相关。在本研究中,我们证实了mi R-199a和DDR1在乳腺癌转移过程中的作用并验证了mi R-199a通过靶向调控基因DDR1的表达发挥其生物学作用。实验一过表达mi R-199a抑制小鼠乳腺癌细胞4T-1的转移目的:观察mi R-199a在乳腺癌转移过程中发挥的作用。方法:构建mi R-199a的表达质粒pc DNA3.1-mi R-199a,利用重组质粒建立稳定过表达mi R-199a的4T-1-Luc小鼠乳腺癌细胞系,并通过QRT-PCR检测技术进行验证。在体外,运用TranswellTM实验研究稳定细胞系的迁移能力,分析mi R-199a对乳腺癌细胞迁移的作用;在体内,将稳定细胞系通过尾静脉注射入免疫力正常的BALB/c小鼠体内,利用荧光素酶活体成像实验观察mi R-199a对乳腺癌细胞体内转移的作用,通过小鼠肺组织的HE(hematoxylin and eosin)染色和免疫组化实验做进一步验证。结果:过表达mi R-199a的小鼠乳腺癌稳定细胞系构建成功;在体外,过表达mi R-199a抑制乳腺癌细胞的迁移;在体内,过表达mi R-199a抑制乳腺癌的肺转移。结论:mi R-199a抑制小鼠乳腺癌的转移。实验二mi R-199a对DDR1的调控关系研究目的:证实DDR1是mi R-199a的下游靶向调控基因。方法:利用生物信息学网站分别预测人和鼠的mi R-199a对DDR1非翻译区(3’UTR)的可能结合位点;克隆野生型DDR1 3’UTR序列以及每一个可能的结合位点突变后的突变型DDR1 3’UTR序列;利用荧光素酶报告基因实验验证mi R-199a对DDR1的直接调控作用和靶向调控位点。结果:mi R-199a可以靶向下调野生型DDR1的表达;确定了mi R-199a调控DDR1的靶向结合位点。结论:DDR1是mi R-199a的下游靶基因。实验三DDR1在乳腺癌转移过程中的生物学作用目的:研究干涉DDR1的表达对乳腺癌转移的作用。方法:构建DDR1的干涉质粒sh DDR1,并且包装重组慢病毒。利用重组慢病毒建立干涉DDR1表达的4T-1-Luc小鼠乳腺癌稳定细胞系,并通过QRT-PCR和Western Blot技术验证细胞系内DDR1的干涉情况。在体外,通过TranswellTM实验研究稳定细胞系的迁移能力,分析DDR1对乳腺癌细胞迁移的作用;在体内,将稳定细胞系经尾静脉注射入免疫力正常的BALB/c小鼠体内,利用荧光素酶活体成像实验分析DDR1对乳腺癌细胞体内转移的作用,通过小鼠肺组织的HE染色和免疫组化实验做进一步验证。结果:干涉DDR1表达的小鼠乳腺癌稳定细胞系构建成功;在体外,干涉DDR1的表达能够抑制乳腺癌细胞的迁移;在体内,干涉DDR1的表达能够抑制乳腺癌的肺转移。结论:干涉DDR1的表达能够抑制小鼠乳腺癌的转移。实验四mi R-199的临床意义研究目的:研究mi R-199与乳腺癌临床预后的相关性。方法:运用TCGA数据库对大样本病例进行统计分析,得到mi R-199与临床乳腺癌患者预后的关系。结果:mi R-199表达量高的乳腺癌患者存活率高。结论:mi R-199表达量与乳腺癌临床预后呈正相关。
【关键词】：乳腺癌 转移 miR-199a DDR1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-31
• 实验一 过表达MIR-199A抑制小鼠乳腺癌细胞 4T-1 的转移31-42
• 引言31
• 1 材料31-32
• 2 方法32-36
• 3 结果36-40
• 4 讨论40-42
• 实验二 MIR-199A与DDR1调控关系的研究42-52
• 引言42
• 1 材料42-43
• 2 方法43-46
• 3 结果46-51
• 4 讨论51-52
• 实验三 干涉DDR1的表达抑制小鼠乳腺癌细胞 4T-1 的转移52-64
• 引言52
• 1 材料52-53
• 2 方法53-56
• 3 结果56-62
• 4 讨论62-64
• 实验四 MIR-199与乳腺癌临床预后相关性64-67
• 引言64
• 1 材料64
• 2 方法64-65
• 3 结果65-66
• 4 讨论66-67
• 小结67-69
• 参考文献69-87
• 个人简历和研究成果87-88
• 致谢88

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本文编号：917921