沉默CHAF1b对人肝癌细胞株SMMC-7721生物学行为的影响

发布时间：2017-09-26 15:12

  本文关键词：沉默CHAF1b对人肝癌细胞株SMMC-7721生物学行为的影响

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【摘要】：目的:1、检测染色质组装因子1(Chromatin assembly factor 1,CAF-1)的亚基p60(CHAF1b)在原发性肝细胞癌组织中的表达情况,并分析其表达与临床病理因素(性别、年龄、肿瘤直径、门静脉侵犯、肝硬化、分化程度、TNM分期)的关系。2、通过检测CHAF1b基因RNAi的重组慢病毒对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖、凋亡、细胞周期、细胞克隆能力的影响,初步阐明CHAF1b在肝癌发生、发展中的作用。方法:1、收集经手术切除的110例肝癌组织及相应的癌旁组织(至少距离癌组织1cm),以及20例正常肝组织,采用免疫组化法检测3种组织中CHAF1b的表达情况,并比较分析其表达差异与临床病理因素(性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、门静脉侵犯、肝硬化、TNM分期)的关系。2、采用real-time PCR在mRNA水平检测目的基因(CHAF1b)在各种人肝癌细胞株(SMMC-7721、HepG2、Hep3B、Huh-7)中的表达情况。3、构建针对CHAF1b基因的RNAi慢病毒表达载体并转染入人肝癌细胞株SMMC-7721,分成CHAF1b-RNAi慢病毒组(实验组)和慢病毒空载组(对照组)。4、采用real-time PCR在mRNA水平检测构建的RNAi慢病毒对人肝癌细胞株SMMC-7721中CHAF1b表达的抑制效果;并检测抑制CHAF1b的表达后对细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞克隆形成能力的影响。结果:1、以CHAF1b抗体行HCC、癌旁组织及正常肝组织免疫组织化学染色,细胞核内出现棕黄色颗粒为CHAF1b表达阳性。CHAF1b在HCC、癌旁组织及正常肝组织中的阳性率分别为63.6%(70/110)、3.6%(4/110)、0.0%(0/20),三者之间差异具有统计学意义(P0.001),其中CHAF1b在肝癌组织中阳性率高于癌旁组织,CHAF1b在肝癌组织中的阳性率高于正常组织,差异均具有统计学意义(P0.001)。CHAF1b在肝癌组织中的表达与性别、年龄、门静脉侵犯、肝硬化、分化程度及TNM分期无关(P0.05),与肿瘤直径有关(P0.05)。2、人肝癌细胞株SMMC-7221中有CHAF1b m RNA显著表达。3、成功构建了针对CHAF1b基因的RNAi慢病毒表达载体,并经PCR和测序鉴定干扰片段的碱基序列及插入位点完全正确。4、构建的RNAi慢病毒感染人肝癌细胞株SMMC-7721后可使CHAF1b mRNA表达量显著下降(P=0.006);Cellomics细胞计数检测细胞生长:实验组细胞的生长明显慢于对照组(P0.05);FACS细胞周期检测:实验组G1的细胞显著减少(P0.05),G2/M期与S期细胞显著增多(P0.05);Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡:实验组发生凋亡的细胞明显高于对照组(P0.05);细胞克隆形成检测:实验组SMMC-7721细胞集落数目明显低于对照组(P0.05);MTT法检测细胞增殖:实验组细胞MTT值比值(即增殖倍数)低于对照组(P0.05)。结论:1.肝癌组织的CHAF1b的表达明显高于癌旁组织及正常肝组织,肝癌组织的CHAF1b的表达情况与性别、年龄、门静脉侵犯、肝硬化、分化程度及TNM分期无关,与肿瘤直径有关。2.人肝癌细胞株SMMC-7721表达CHAF1b。3.构建的针对CHAF1b基因的RNAi慢病毒表达载体能有效抑制CHAF1b基因的表达,干扰CHAF1b基因表达后能显著抑制的人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖能力,促进其凋亡,影响其细胞周期。
【关键词】：CHAF1b 肝细胞癌 SMMC-7721 RNA干扰
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 中英文缩略词表11-12
• 第1章 引言12-14
• 第2章 CHAF1b在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义14-19
• 2.1 研究对象14
• 2.2 主要仪器和试剂14-15
• 2.2.1 主要仪器14-15
• 2.2.2 主要试剂15
• 2.3 实验步骤15
• 2.4 设立对照15-16
• 2.5 结果判定16
• 2.6 统计学分析方法16
• 2.7 结果16-18
• 2.7.1 肝癌组、癌旁组、正常组中CHAF1b的表达16-17
• 2.7.2 CHAF1b的表达与肝癌临床病理学特征的关系17-18
• 2.8 结论18-19
• 第3章 CHAF1b在人肝癌细胞株中的表达19-24
• 3.1 实验材料19
• 3.1.1 研究对象19
• 3.1.2 主要仪器与试剂19
• 3.2 实验方法19-23
• 3.2.1 引物设计19-20
• 3.2.2 实验步骤20-23
• 3.3 统计学分析方法23
• 3.4 结果23
• 3.5 结论23-24
• 第4章 CHAF1b基因RNA干扰慢病毒载体的构建与包装24-34
• 4.1 实验材料24-25
• 4.1.1 慢病毒载体系统24
• 4.1.2 细胞与菌株24
• 4.1.3 主要仪器24
• 4.1.4 主要试剂24-25
• 4.2 实验方法25-31
• 4.2.1 CHAF1b基因RNA干扰慢病毒载体的制备25-29
• 4.2.2 慢病毒包装29-31
• 4.3 结果31-33
• 4.3.1 载体酶切线性化31
• 4.3.2 目的基因阳性克隆31-32
• 4.3.3 阳性克隆测序结果分析32-33
• 4.4 结论33-34
• 第5章 重组慢病毒对人肝癌细胞株SMMC-7721的生物学影响34-44
• 5.1 研究对象34
• 5.2 主要仪器和试剂34-35
• 5.2.1 主要仪器34
• 5.2.2 主要试剂34-35
• 5.3 实验方法35-38
• 5.3.1 慢病毒感染目的细胞35-36
• 5.3.2 Real-time PCR检测敲减效率36
• 5.3.3 Cellomics细胞计数检测细胞生长36
• 5.3.4 FACS细胞周期检测36-37
• 5.3.5 Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡37
• 5.3.6 细胞克隆形成检测37
• 5.3.7 MTT法检测细胞增殖37-38
• 5.4 统计学分析方法38
• 5.5 结果38-42
• 5.5.1 慢病毒转染效率检测38-39
• 5.5.2 Real-time PCR检测敲减效率结果39-40
• 5.5.3 Cellomics细胞计数检测细胞生长结果40
• 5.5.4 FACS细胞周期检测结果40-41
• 5.5.5 Annexin V-APC单染法流式细胞仪检测细胞凋亡结果41
• 5.5.6 细胞克隆形成检测结果41-42
• 5.5.7 MTT法检测细胞增殖结果42
• 5.6 结论42-44
• 第6章 讨论44-47
• 6.1 目的基因的选择44
• 6.2 免疫组织化学技术和Real-time PCR44-45
• 6.3 RNA干扰技术与慢病毒载体45
• 6.4 实验设计45
• 6.5 实验结论45-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-52
• 综述52-58
• 参考文献56-58

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