CRIM1促进非小细胞肺癌粘附与迁移的功能研究

发布时间：2017-09-26 23:07

  本文关键词：CRIM1促进非小细胞肺癌粘附与迁移的功能研究

  更多相关文章： 富半胱氨酸运动神经元蛋白1 转化生长因子β1 上皮间质化 E-钙粘素 N-钙粘素

【摘要】：富含半胱氨酸型运动神经元蛋白1(CRIM1)是一类富含半胱氨酸的跨膜蛋白,该蛋白是新发现的拮抗BMPs蛋白家族的一个成员,早前对于CRIM1的研究主要是在于胚胎和器官发育以及肾纤维化疾病当中。基于其早前报道的功能,我们推测该蛋白可能在癌细胞的粘附和迁移行为当中有着重要的作用,并可能进一步影响到癌细胞的表皮间质转化行为。本文的主要研究内容:检测在不同转染条件下si RNA转染后的沉默效率,通过q PCR,westernblot检测CRIM1的基因和蛋白的表达量,进而筛选出最适si RNA转染条件。结果显示,在转染后48h,转染试剂与si RNA体积比在1:1的情况下,A549中CRIM1的表达水平下调达到最佳。通过si RNA转染抑制CRIM1表达表达和加入CRIM1多肽诱导处理两种方式对A549细胞进行处理,用MTT法分析CRIM1对A549细胞增殖能力的影响,结果显示CRIM1对A549细胞增殖能力无明显影响;通过伤痕愈合法分析CRIM1对A549细胞迁移能力的影响,结果显示CRIM1对A549细胞迁移能力为正调控;通过粘附分析法分析CRIM1对A549细胞粘附能力的影响,结果显示CRIM1对A549细胞粘附能力为正调控。得出结论:CRIM1对A549细胞的迁移和粘附呈正调控,而对其增殖无显著影响。鉴于CRIM1可以影响细胞的粘附和迁移行为,因此我们怀疑该蛋白参与细胞EMT。先用TGFβ1诱导A549细胞发生EMT后,通过进一步实验分析CRIM1是否参与到A549细胞EMT的过程当中。结果显示CRIM1在EMT过程中呈现蛋白上调,但CRIM1多肽诱导并不能使细胞发生EMT。此外,CRIM1的加入也无法诱导和逆转EMT的发生。CRIM1沉默后蛋白表达结果显示CRIM1的沉默可以使N-CAD,E-CAD的蛋白表上调。得出结论:CRIM1不能直接诱导细胞发生EMT,它可能并不直接参与到EMT的过程当中,但是CRIM1的沉默对于N-CAD,E-CAD蛋白的表达有影响。我们构建了原癌基因YAP1真核表达质粒pc DNA3.1(+)-EGFP-YAP1,并将其转染到A549细胞以过表达Hippo信号通路关键因子YAP1,研究CRIM1基因与Hippo信号通路之间的关系。检测结果显示我们成功地在A549中过表达了YAP1基因,并检测到了细胞中CRIM1表达的显著上调。得出结论:CRIM1的表达受到Hippo信号通路的调控。
【关键词】：富半胱氨酸运动神经元蛋白1 转化生长因子β1 上皮间质化 E-钙粘素 N-钙粘素
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要3-4
• 英文摘要4-11
• 主要缩略词11-13
• 1 绪论13-19
• 1.1 研究背景13-15
• 1.1.1 CRIM1 蛋白13
• 1.1.2 CRIM1 是癌相关蛋白的可能性探讨13-15
• 1.1.3 肺癌的危害和分类15
• 1.2 本文创新点15
• 1.3 本文研究的目的，意义和内容15-19
• 1.3.1 本研究的目的和意义15-16
• 1.3.2 本研究的主要内容16
• 1.3.3 本研究的技术路线16-19
• 2 A549 细胞的培养和观察19-23
• 2.1 引言19
• 2.2 实验材料和设备19-20
• 2.2.1 细胞株19
• 2.2.2 细胞培养仪器19-20
• 2.2.3 细胞培养材料20
• 2.2.4 相关实验材料准备20
• 2.2.5 相关实验试剂配制以及材料准备20
• 2.3 实验方法实验结果20-22
• 2.3.1 细胞的复苏与冻存21
• 2.3.2 细胞的换液和传代21-22
• 2.4 细胞形态观察22
• 2.5 本章小结22-23
• 3 siRNA转染条件摸索以及沉默效率的确定23-39
• 3.1 引言23
• 3.2 实验材料准备与siRNA的合成23-25
• 3.2.1 实验细胞23
• 3.2.2 实验装置和仪器23-24
• 3.2.3 实验材料和试剂24-25
• 3.3 实验方法25-32
• 3.3.1 细胞转染条件摸索25
• 3.3.2 总RNA提取、检测与反转录25-27
• 3.3.3 RT-PCR检测基因表达27-28
• 3.3.4 总蛋白提取28
• 3.3.5 蛋白含量测定28-29
• 3.3.6 Western blot检测蛋白表达29-32
• 3.4 实验结果32-36
• 3.4.1 siRNA转染条件的选择32-33
• 3.4.2 SiRNA转染后沉默效率的确定33-36
• 3.5 讨论36-37
• 3.6 本章小结37-39
• 4 CRIM1 对A549 细胞增殖行为的影响39-45
• 4.1 引言39
• 4.2 实验材料和设备39-40
• 4.2.1 实验细胞39
• 4.2.2 实验装置与仪器39-40
• 4.2.3 实验材料和试剂40
• 4.2.4 相关实验试剂配制40
• 4.3 实验方法40-41
• 4.3.1 siRNA的转染40-41
• 4.3.2 CRIM1 多肽处理A549 细胞41
• 4.3.3 MTT法检测增殖41
• 4.4 实验结果41-43
• 4.4.1 CRIM1 的沉默对A549 细胞增殖的作用41-42
• 4.4.2 CRIM1 多肽对于A549 细胞增殖的影响42-43
• 4.5 讨论43
• 4.6 本章小结43-45
• 5 CRIM1 对A549 细胞迁移的影响45-51
• 5.1 引言45
• 5.2 实验材料和设备45-46
• 5.2.1 实验细胞45
• 5.2.2 细胞培养的装置和仪器45-46
• 5.2.3 实验材料和试剂46
• 5.3 实验方法46
• 5.3.1 siRNA的转染后划痕46
• 5.3.2 加入CRIM1 多肽并划痕46
• 5.4 实验结果46-49
• 5.4.1 CRIM1 的沉默抑制A549 细胞迁移46-47
• 5.4.2 加入CRIM1 多肽促进A549 细胞迁移47-49
• 5.5 讨论49
• 5.6 本章小结49-51
• 6 CRIM1 对A549 细胞粘附的影响51-57
• 6.1 引言51
• 6.2 实验材料和设备51-52
• 6.2.1 实验细胞51
• 6.2.2 细胞培养的装置和仪器51
• 6.2.3 实验材料和试剂51-52
• 6.2.4 相关试剂的配制52
• 6.3 实验方法52-53
• 6.3.1 siRNA的转染52
• 6.3.2 CRIM1 多肽处理细胞52
• 6.3.3 粘附分析52-53
• 6.4 实验结果53-54
• 6.4.1 CRIM1 的沉默抑制A549 细胞粘附53
• 6.4.2 加入CRIM1 多肽促进A549 细胞粘附53-54
• 6.5 讨论54-55
• 6.6 本章小结55-57
• 7 CRIM1 与EMT之间的关系的研究57-69
• 7.1 引言57-58
• 7.2 实验材料和方法58-59
• 7.2.1 实验细胞58
• 7.2.2 实验装置和仪器58
• 7.2.3 实验材料和试剂58-59
• 7.3 实验方法59-63
• 7.3.1 TGFβ1 诱导EMT59
• 7.3.2 CRIM1 加样诱导59-60
• 7.3.3 CRIM1 参与的TGFβ1 诱导60
• 7.3.4 siRNA的转染60
• 7.3.5 总RNA的提取、检测及反转录60
• 7.3.6 RT-PCR检测基因的表达60-61
• 7.3.7 q-PCR检测基因表达61-62
• 7.3.8 总蛋白的提取62
• 7.3.9 蛋白含量检测62
• 7.3.10 Western blot检测目的蛋白表达量62-63
• 7.4 实验结果63-67
• 7.4.1 A549 发生EMT过程中CRIM1 表达检测63-64
• 7.4.2 CRIM1 与EMT64-67
• 7.5 讨论67-68
• 7.6 本章小结68-69
• 8 CRIM1 与Hippo信号通路的关系初探69-85
• 8.1 引言69-70
• 8.2 实验材料和设备70-72
• 8.2.1 主要仪器和设备70-71
• 8.2.2 主要试剂71-72
• 8.3 实验方法72-79
• 8.3.1 实验准备工作72
• 8.3.2 获得目的片段72-74
• 8.3.3 质粒构建74-75
• 8.3.4 筛选阳性菌落75-76
• 8.3.5 质粒提取76
• 8.3.6 质粒转染76-77
• 8.3.7 目的基因表达检测77-78
• 8.3.8 目的基因蛋白表达检测78-79
• 8.4 实验结果79-81
• 8.4.1 pcDNA3.1（+）-EGFP- YAP1 的构建79
• 8.4.2 YAP1 的过表达以及相关基因和蛋白的检测79-81
• 8.5 讨论81-83
• 8.6 本章小结83-85
• 9 结论与展望85-87
• 9.1 主要结论85
• 9.2 展望85-87
• 致谢87-89
• 参考文献89-95
• 附录95
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文95
• B. 作者在攻读学位期间获得的专利95

【参考文献】

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1 陈汝福,邹声泉;血管生成在肝门部胆管癌发生发展中作用的研究[J];中华普通外科杂志;2000年06期

2 高进,李存玺;细胞粘附机制与癌细胞侵袭和转移[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1995年04期

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本文编号：926236