CREB在脑胶质瘤中的表达及敲除后对肿瘤细胞生物学特性的影响

发布时间：2017-09-27 19:17

  本文关键词：CREB在脑胶质瘤中的表达及敲除后对肿瘤细胞生物学特性的影响

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【摘要】：目的:探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)在脑胶质瘤组织中的表达情况,以及应用CRISPR/Cas9技术敲除CREB后对人脑胶质瘤细胞系U251增值、迁移、侵袭、凋亡及体外成瘤的影响方法:一、组织检测1)采集术后不同级别的人脑胶质瘤标本,并收集正常颅脑外伤减压术后的脑组织作为空白对照,采用免疫组化法、RT-PCR、Western blot检测肿瘤标本CREB的表达情况。二、细胞检测1)建立稳定敲除的细胞系:采用CRISPR/Cas9技术敲除胶质瘤U251细胞系中的CREB基因,并建立稳定敲除的细胞株;并通过Cruiser?酶切筛选阳性KO克隆、Western blot检测敲除后的U251细胞系中CREB的表达情况;2)CRISPR/Cas9敲除CREB后对肿瘤细胞增殖的影响:采用CCK-8法检测通过CRISPR/Cas9敲除后的U251细胞株细胞增殖速度的改变并Western blot检测Cyclin D1的蛋白表达情况。3)CRISPR/Cas9敲除CREB后对肿瘤细胞迁移、侵袭的影响:采用Transwell小室检测敲低CREB前后U251细胞株迁移、侵袭能力的改变并Western blot检测E-cadherin的蛋白表达情况。4)CRISPR/Cas9敲除CREB后对肿瘤细胞凋亡的影响,并探究敲除后对ERK-CREB、PI3激酶/Akt-CREB两条重要的磷酸化信号通路影响,采用Western blot检测bcl-2、bax、p ERK、p Akt的蛋白表达情况。三、裸鼠检测1)U251细胞系裸鼠成瘤检测:BALB/C-nu裸鼠作为动物研究模型,将裸鼠随机分组,分别收集U251、U251-NT及U251-KO细胞进行皮下注射,绘制各组动物皮下移植瘤生长曲线,并对活体肿瘤标本中CREB的表达进行Western blot检测分析。结果:1)CREB在不同分化程度脑胶质瘤组织中均存在过表达现象,且不同级别胶质瘤中表达量有统计学意义(P0.05),与肿瘤的分化程度呈正相关(P0.05)2)CRISPR/Cas9敲除后的U251稳定细胞株中CREB的m RNA以及蛋白含量明显降低(P0.05)。3)CRISPR/Cas9敲除后的U251稳定细胞株增殖、迁移以及侵袭能力明显降低,细胞凋亡增加,其磷酸化信号通路相关蛋白表达量也有明显变化,以上指标与对照组相比,均有统计学意义(P0.05)。4)CRISPR/Cas9敲除后的U251稳定细胞株在裸鼠的成瘤能力与对照组相比,明显下降。结论:CREB在不同分化程度脑胶质瘤组织中均存在过表达现象,与肿瘤的分化程度呈正相关。在CRISPR/Cas9稳定敲除后的U251稳定胶质瘤细胞株中,细胞的增殖、迁移、侵袭以及裸鼠成瘤能力均下降,凋亡水平增加,因此我们推测CREB可能在胶质瘤发生发展过程中起着重要的调节作用。
【关键词】：CREB CRISPR/Cas9 胶质瘤
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一章 CREB在脑胶质瘤组织中的表达及临床意义12-17
• 1 资料与方法12-14
• 1.1 标本资料12-13
• 1.2 方法13-14
• 1.3 统计学方法14
• 2 结果14-17
• 2.1 免疫组化检测CREB在胶质瘤组织中的表达14-16
• 2.2 RT-PCR、Western blot检测CREB在组织中的表达16-17
• 第二章 CRISPR/Cas9介导的目的基因敲除17-22
• 1 材料与方法17-19
• 1.1 试验材料17
• 1.2 主要仪器17
• 1.3 试验方法17-19
• 2 实验结果19-21
• 2.1 实验参数19
• 2.2 结果检测19-21
• 3 结论21-22
• 第三章 CRISPR/Cas9特异性敲除CREB对胶质瘤U251细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响22-27
• 3.1 材料与方法22-23
• 3.2 结果23-26
• 3.3 结论26-27
• 第四章 CRISPR/Cas9特异性敲除CREB的U251细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响27-34
• 4.1 实验材料27
• 4.2 实验方法27-28
• 4.3 实验结果28-29
• 4.4 讨论（一至四章）29-34
• 第五章 结论34-35
• 参考文献35-37
• 综述37-46
• 参考文献44-46
• 致谢46-47
• 研究生期间所发表文章47

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本文编号：931455