转录因子c-Jun通过启动子激活机制上调原癌基因miR-744的表达

发布时间：2017-09-27 20:22

  本文关键词：转录因子c-Jun通过启动子激活机制上调原癌基因miR-744的表达

  更多相关文章： miR-744 c-Jun 鼻咽癌 非小细胞肺癌 迁移 侵袭

【摘要】：背景：随着肿瘤的相关机制研究及治疗技术的不断发展,我们对于肿瘤的发生发展有了更深入的了解。肿瘤细胞侵犯正常机体的一个重要特性即是其转移性。尽管我们对于这个复杂的过程的理解不断深入,但癌症转移仍然是癌症患者治疗失败的主要原因,。因此,探索和描述参与包括细胞迁移和侵袭在内的转移初始步骤的相关基因,可能提供给我们控制癌症转移的新目标。MicroRNAs (miRNAs)是高度保守的非编码,小分子RNA,它们被报道能通过转录后抑制,信使RNA降解,或者启动子的激活来调控转移相关基因,从而参与调控转移过程,发挥正向或负向的作用。miR-744最近被确定为一个新的肿瘤相关基因,在头颈部肿瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、乳腺癌患者的血清标本中均发现其表达水平的异常。我们以前也报道过,miR-744在人的鼻咽癌组织标本中的表达上调,以及miR-744的上调与鼻咽癌的进展显著相关。此外,我们首次证实了miR-744是一个参与癌症转移的复杂过程过程的原癌基因。然而,miR744在肿瘤中表达调控失调的机制从未被报道。只有Sanchez-Jimenez C等人发现,在HeLa细胞系(子宫颈癌细胞)中,miR-744的表达增加与作为细胞内稳态监管者的t细胞胞内抗原(TIA)的瞬时消耗有关。调控microRNA表达有几种机制,如基因结构的改变,,microRNA生物起源机制的缺陷,表观遗传的变化等等。转录因子活性的改变也是microRNA表达失调的一个重要调节机制。例如,肌原性的转录因子MyoD可以直接结合miR-182的启动子区域,从而促进miR-182表达,导致肿瘤进展。肿瘤蛋白MYC既能够正向调节癌基因miR-17-92家族的转录,也可以直接抑制抑癌基因let-7与miR-29家族的转录。目的：通过生物信息学预测技术,筛选出与miR-744上游启动子区域存在结合位点的转录因子,利用qPCR技术验证转录因子与miR-744表达的相关性,再运用染色质免疫共沉淀(CHIP)技术确定转录因子与miR-744的直接结合位点,并用双荧光素酶报告实验进行进一步验证。最后,再在鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549中探索二者在肿瘤细胞的迁移与侵袭方面的共同作用机制。从而确定调控促癌基因miR-744表达的转录因子及其作用机制。方法：通过生物信息学预测软件PROMO2.0,预测出与miR-744上游启动子区域2kb内可能存在结合位点的转录因子。接着,根据预测结果,我们构建了转录因子的过表达质粒及小干扰RNA,选择鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549进行瞬时转染,培养48小时后使用TRIZOL方法提取细胞中的RNA,用poliA加尾法逆转录成cDNA后进行qPCR,检测细胞株中miR-744的表达情况,与空白对照组进行比较,从而探索转录因子与miR-744表达的相关性。接着,我们运用染色质免疫共沉淀技术(CHIP),特异性的研究转录因子与miR-744启动子区域的直接结合位点。我们选择了肺癌细胞株A549来进行染色质免疫共沉淀实验,用转录因子的过表达质粒转染后培养48小时,再依次进行细胞的甲醛交联和超声破碎,除杂与抗体孵育,超声破碎效果的检验,免疫复合物的沉淀以及清洗,DNA样品的回收,最后使用设计的针对结合位点的特异性引物进行qPCR扩增,分析。从而发现转录因子与miR-744启动子区的直接结合位点。然后,我们进行了双荧光素酶报告实验,进一步验证转录因子与miR-744启动子区域的结合。首先,我们用片段裁切法将miR-744的启动子区2kb长度的序列裁切成-2OOObp～-1 bp,-1000bp～-1 bp,-500bp～-1bp的三段序列并构建他们的萤火虫荧光质粒,与海肾荧光素酶质粒共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,培养48小时后检测荧光素酶活性并进行分析,从而确定miR-744的核心启动子区域,再挑选位于核心启动子区域中的结合位点进行下一步研究。我们将核心启动子区域的荧光素酶质粒与转录因子的过表达质粒共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,培养48小时,检测荧光素酶活性,通过与单独转染核心启动子区域的荧光素酶质粒的细胞株的荧光比较,进一步验证了转录因子可以通过作用于miR-744的核心启动子区域来调控miR-744的转录。接下来,我们构建了特异性突变转录因子与miR-744结合位点突变的核心启动子区域的突变型荧光素酶质粒,将其与转录因子过表达质粒共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,通过比较miR-744核心启动子区域野生型和转录因子过表达质粒共转染的细胞株的荧光活性,最终确定了转录因子对miR-744表达的调控是通过直接结合位于miR-744核心启动子区域的结合位点来发挥作用的。最后,我们进行了细胞功能实验,通过划痕实验和TRANSWELL实验来验证miR-744是否介导了c-Jun的促肿瘤细胞迁移与侵袭过程。将转录因子过表达质粒与miR-744的抑制剂anti-miR-744共转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1, A549,用20uL的枪头划痕,孵育36小时后在倒置显微镜下拍照,比较它们的划痕愈合程度,从而比较鼻咽癌和非小细胞肺癌细胞株在迁移性上与单独转染转录因子过表达质粒的细胞株的差异,再进行transwell实验,transwell小室分为铺基质胶与不铺基质胶两种,每个小室内种入一定量的细胞,孵育24小时后用甲醛固定,苏木素染色在倒置显微镜下拍照,随机选取几个视野统计穿膜细胞的数目,取平均值计算出鼻咽癌和非小细胞肺癌细胞株的穿膜细胞数,从而发现它们在迁移性与侵袭性上与单独转染转录因子过表达质粒的细胞株的差异,从而得出miR-744介导了c-Jun促肿瘤细胞迁移侵袭功能的结论。结果：我们使用PROMO2.0软件,将miR-744启动子区域上游2kb的片段输入软件进行筛选。生物信息学预测显示,转录因子c-Jun与miR-744的上游启动子区域2kb长度内存在6个可能的结合位点,分别是：-1482 to-1488 bp,-1311to -1317 bp,-890 to -896 bp,一1261 to -1267 bp,-1582 to-1588 bp and-343 to-349bp,。转染c-Jun过表达质粒后,运用qPCR技术检测miR-744表达,发现鼻咽癌细胞株5-8 F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1,A549中miR-744表达较空白对照组明显上调,而转染c-Jun干扰RNA的细胞株的miR-744的表达较空白对照组明显下调,这些结果表明c-Jun能够调控miR-744的表达,并且极有可能是通过与miR-744的启动子区域结合来调控miR-744的转录。在染色质免疫共沉淀实验CHIP中,我们设计了4种引物,分别针对-1482～-1488 bp与-1582～-1588 bp,-1311～-1317 bp与-1261～-1267 bp,-890～-896 bp,-343～-349 bp进行特异性扩增,qPCR结果显示,c-Jun在miR.744启动子区域的-1482～-1488 bp与-1582～-1588 bp,-1311-1317 bp与-1261～-1267 bp,-890--896bp,-343～-349bp上均可直接结合。说明c-Jun对miR-744转录的调控是通过直接结合到miR-744启动子区域的结合位点而发挥作用的,而双荧光素酶报告实验发现miR-744的核心启动子区域为-500bp～-1bp,-343 to -349 bp位于这个区域内,因此预示着c-Jun对miR-744的转录调控最有可能是通过直接结合在-343～-349 bp。进一步的双荧光素酶实验证实了这一点。通过使用c-Jun过表达质粒转染鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1,A549后,miR-744的-500bp~-1bp片段的荧光活性较单独转染-500bp～-1bp的细胞株显著上升,从而说明c-Jun可通过作用于miR-744核心启动子区域-500bp～-1bp来影响miR-744转录。同时,共转染c-Jun过表达质粒与miR-744核心启动子区域野生型的鼻咽癌细胞株5-8F,HONE 1和肺癌细胞株SPC-A-11,A549中,荧光活性较共转染特异性突变转录因子与miR-744结合位点突变的核心启动子区域的突变型荧光素酶质粒的细胞株有显著上升,从而证实了c-Jun可通过直接结合于miR-744启动子区域的-343 to-349 bp,调控miR-744的转录。在细胞功能实验中,我们进行了细胞划痕实验与TRNSWELL实验来探讨迁移与侵袭。转染了c-Jun过表达质粒的鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1和肺癌细胞株SPC-A-1,A549株孵育36小时后,划痕愈合程度较空白对照组显著加快,而共转染c-Jun过表达质粒和miR-744抑制剂anti-miR-744的细胞株的划痕愈合程度较空白对照组则无明显变化。在transwell实验中,有基质胶与无基质胶的情况下,转染了c-Jun过表达质粒的鼻咽癌细胞株5-8F,HONE1口肺癌细胞株SPC-A-1, A549株的穿膜细胞数目较空白对照组均有显著增加,而共转染c-Jun过表达质粒和miR-744抑制剂anti-miR-744的细胞株的穿膜细胞数目较空白对照组则无明显变化。这些结果表明miR-744介导了转录因子c-Jun促肿瘤细胞迁移侵袭功能结论：在这项研究中,我们发现1.miR-744的转录可被c-Jun上调2.c-Jun通过直接结合到miR-744的启动子区调控miR-744的转录3.miR-744介导了c-Jun的促肿瘤细胞迁移侵袭功能。3.我们的数据首次证明了c-Jun作用于原癌基因miR-744的转录调控机制,并且揭示了miR-744在肿瘤中表达上调的潜在机制,为进一步研究miR-744提供了方向。
【关键词】：miR-744 c-Jun 鼻咽癌 非小细胞肺癌 迁移 侵袭
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-21
• 参考文献19-21
• 第一部分 C-JUN上调MIR-744的转录21-33
• 前言21
• 1 材料和方法21-27
• 2 实验结果27-30
• 3 讨论30-31
• 参考文献31-33
• 第二部分 C-JUN直接结合MIR-744启动子区从而调控其转录33-55
• 前言33-34
• 1 材料和方法34-45
• 2 实验结果45-51
• 3 讨论51-53
• 参考文献53-55
• 第三部分 MIR-744介导了C-JUN促肿瘤细胞迁移侵袭功能55-67
• 前言55
• 1 材料和方法55-62
• 2 实验结果62-65
• 3 讨论65-66
• 参考文献66-67
• 全文总结67-69
• 缩略词表69-70
• 攻读学位期间成果70-71
• 致谢71-73

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 温进坤;;磷酸化作用对转录因子活性的调节[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1993年05期

2 刘楠;陈依军;;转录因子——新型抗肿瘤药物作用靶点[J];中国药科大学学报;2010年02期

3 张春霞;任少敏;李维才;;儿童急性特发性血小板减少性紫癜转录因子的表达[J];内蒙古医学杂志;2013年10期

4 林玫;刘辉国;;氧化还原敏感转录因子与阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征[J];国际呼吸杂志;2006年09期

5 金红;邱文冰;彭庚;王东明;李玉光;;睾酮对人脐静脉内皮细胞部分转录因子活性的影响[J];中国应用生理学杂志;2008年03期

6 张维山,冷启新;转录因子假结合体的基因治疗作用[J];解剖科学进展;2003年01期

7 陈子兴;转录因子和造血分化调控及其意义[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);2003年03期

8 李德,何国祥;血管平滑肌细胞增殖相关转录因子的研究进展[J];中国介入心脏病学杂志;2004年03期

9 江洪;基因表达与转录因子[J];生物学通报;1998年04期

10 李扬秋;转录因子GATA的发现及其在造血系统的研究进展[J];国外医学.输血及血液学分册;1996年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 吴秀丽;李扬秋;王震;杨力建;陈少华;张洹;朱康儿;韩忠朝;;转录因子GATA-1基因在白血病骨髓基质细胞中的表达[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

2 易可可;吴忠长;周洁;张麝龙;吴运荣;刘非燕;吴平;;植物磷饥饿调控转录因子研究[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年

3 宗英;袁伯俊;陆国才;;活化转录因子4在辐射诱导的损伤中的作用及机制[A];中国药理学与毒理学杂志(2013年6月第27卷第3期)[C];2013年

4 易可可;吴忠长;周洁;吴运荣;吴平;;植物耐低磷转录因子研究[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年

5 胡明辉;胡令彦;周永明;陈海琳;;Th17/Treg相关转录因子在非重型再生障碍性贫血中的意义及与中医肾虚分型相关性[A];中华中医药学会第二届岐黄论坛——血液病中医药防治分论坛论文集[C];2014年

6 何男男;王文洁;薛晓锋;魏琦超;周岩;;HD-Zip转录因子研究进展[A];河南省细胞生物学学会第二届会员代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2009年

7 王黎芳;;转录因子FBI-1的研究进展[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年

8 魏海明;田志刚;;转录因子对Th1/Th2分化的调控作用[A];第七届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2001年

9 吕彦霞;张海娟;张梅;余小林;;植物NAC转录因子的研究进展[A];中国园艺学会十字花科蔬菜分会第十届学术研讨会论文集[C];2012年

10 金肆;;基于ELISA技术的转录因子检测方法[A];新观点新学说学术沙龙文集23：新药发现——寻找维护人类健康的武器[C];2008年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 郭洋;植物也会“抗洪”[N];大众科技报;2011年

2 白毅;UXT蛋白可增强转录因子NF—κB活性[N];中国医药报;2007年

3 胡德荣;“转录蛋白”调控异常可激活肿瘤细胞[N];健康报;2007年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 赖秘;多重组学手段研究蛋白UHRF2的生物学功能及其机制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2016年

2 徐冬玲;转录因子MEF2A、KLF2在血管性疾病中的临床和基础研究[D];山东大学;2016年

3 韩晓敏;中间锦鸡儿3个非生物胁迫相关转录因子的克隆与功能分析[D];内蒙古农业大学;2015年

4 武正华;转录因子Sal-like protein 2调控p16~(INK4A)表达机制的研究[D];上海交通大学;2015年

5 郑广勇;哺乳动物转录因子及其靶基因的挖掘分析[D];复旦大学;2009年

6 刚毅;功能封闭性双链RNA在胃癌耐药相关转录因子验证中的应用[D];第四军医大学;2012年

7 李婧;小鼠bHLH转录因子家族预测及其大脑调控网络的构建[D];上海交通大学;2007年

8 田云;转录因子JERFs功能的初步研究[D];湖南农业大学;2008年

9 张洪博;ERF转录因子TSRF1的功能分析[D];中国农业大学;2005年

10 王雪根;以转录因子为靶的抗肿瘤药物DECOY寡聚核苷酸研究[D];南京工业大学;2003年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 郭文婕;鸡转录因子GATA2影响单糖转运蛋白基因GLUT2、GLUT5和SGLT1表达的研究[D];山西农业大学;2015年

2 王昕嘉;转录因子GmbHLH30在丹波黑大豆响应铝胁迫过程中调控靶基因的作用机理研究[D];昆明理工大学;2015年

3 张永兴;水稻MYB转录因子TF865调控株高的功能研究[D];中国农业科学院;2015年

4 牛芳芳;油菜NAC103与拟南芥WSK1转录因子分别调控ROS依赖的细胞死亡与低钾应答的分子机制解析[D];西北农林科技大学;2015年

5 陈为峰;黄瓜转录因子CsbZIP家族基因部分成员的克隆及表达分析[D];西北农林科技大学;2015年

6 周阳云;茉莉酸信号途径关键转录因子SmMYC2调控丹参有效成分生物合成的功能解析[D];福建中医药大学;2015年

7 高秀梅;豆科植物中转录因子NSP1、NSP2和IPN2对结瘤起始基因调控的研究[D];华中农业大学;2015年

8 陈泓宇;桑树MYB转录因子家族的生物信息学及黄酮合成相关基因的表达分析[D];西南大学;2015年

9 高婷;基于限制性内切酶构建的荧光生物传感器用于转录因子检测[D];山东大学;2015年

10 汤旋;玉米纹枯病菌自激活转录因子的系统筛选[D];华中农业大学;2015年

，

本文编号：931732