白藜芦醇增敏卡非佐米对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用及其机制研究

发布时间：2017-09-28 02:14

  本文关键词：白藜芦醇增敏卡非佐米对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用及其机制研究

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【摘要】：目的:1.探究白藜芦醇(resveratrol,RSV)对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞增殖活力的影响。2.探究RSV能否增敏卡非佐米(carfilzomib,CFZ)对MM细胞的杀伤作用及增敏的可能机制,为CFZ联合RSV应用于MM的治疗提供一定的实验基础。3.探究RSV联合CFZ作用MM细胞后细胞内自噬水平的变化,并且通过抑制自噬途径观察MM细胞凋亡水平的变化,为进一步提高增敏作用提供新的思路。方法:1.MTT法检测RSV对MM细胞增殖活力的影响:以4种MM细胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R为研究对象,用不同浓度梯度的RSV孵育MM细胞24 h后,采用MTT比色法检测细胞增殖活力的变化。然后用最小抑制浓(minimum inhibitory concentration,MIC)分别处理各细胞株24 h、48 h、72 h后观察细胞增殖活力的变化。2.MTT法检测RSV预处理前后CFZ对MM细胞生长抑制作用的变化:根据方法1的实验结果,选择对RSV最敏感的MM细胞株LP-1为研究对象。将实验分为两组:组1用50μmol/L RSV预处理LP-1细胞24 h后,移除RSV换新的培养基后,再给予不同浓度CFZ处理24 h;组2直接用不同浓度梯度的CFZ孵育LP-1细胞24 h,MTT实验检测CFZ对MM细胞的增殖抑制作用,并分别得出组1与组2的CZF的IC50。3.流式细胞术测周期实验检测细胞周期的变化:将实验分设为四组:对照组、RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组。对照组:不给予处理;RSV组:50μmol/L RSV孵育LP-1细胞24 h;CFZ组:40nmol/L CFZ孵育细胞24 h;RSV+CFZ组:50μmol/L RSV预处理LP-1细胞24 h后,移除RSV后并再给予CFZ 40 nmol/L孵育24 h。收集细胞PI染色上流式机检测细胞周期的变化。4.流式细胞术测凋亡实验检测MM细胞凋亡率的变化:同方法3将实验分设为4组,给予不同的处理后收集细胞FITC/PI染色上流式机检测各组细胞凋亡率。5.流式细胞术测活性氧(reactive oxygen species,ROS)实验检测ROS变化:同方法3将实验分设为4组,给予LP-1细胞不同的处理后收集细胞加入荧光探针DCFH-DA,采用流式细胞术检测各组细胞内ROS水平。6.加入活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,NAC)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)后MM细胞内ROS的变化及凋亡的变化:实验分设为8组,分别为对照组、RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组、NAC组、NAC+RSV+CFZ组、3-MA组、3MA+RSV+CFZ组,3 mmol/L NAC预处理LP-1细胞2 h后,1 mmol/L 3-MA预处理LP-1细胞1 h后,再给予方法4、5处理,采用流式细胞术检测各组ROS水平及凋亡率的变化。7.Western bloting实验检测两药联合作用凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白LC3I/II的表达水平以及加入3-MA后自噬及凋亡相关蛋白的表达变化;同方法3将实验分为4组,给予不同的处理后收集细胞,采用Western bloting检测细胞周期相关蛋白p38 MAPK、抗凋亡蛋白survivin,Sirt1以及促凋亡蛋白smac、caspase 3的表达水平,同时检测自噬相关蛋白LC3 I/II的表达变化。加入自噬抑制剂3-MA后再给予RSV+CFZ后LC3 I/II及caspase 3的表达变化。8.Smac的小干扰RNA(si RNA)转染细胞后检测凋亡相关蛋白的表达水平:将实验分设为4组:对照组、RSV+CFZ组、si RNA、si RNA+RSV+CFZ组,采用Western bloting检测抗凋亡蛋白survivn,sirt-1以及促凋亡蛋白Smac、的表达水平。9.所有实验数据均采用SPSS17.0统计学软件、Graph Pad Prism 5进行数据分析,采用Graph Pad Prism 5作图,Photoshop对Western blotting进行整理、分析,P0.05为差异具有统计学意义。结果:1.MTT实验结果得出:RSV对4种MM细胞株LP-1、U266、MM.1S、MM.1R均具有生长抑制作用,并且随着浓度增加,抑制作用逐渐增强(n=3,P0.05)。以各自MIC分别处理细胞24、48、72 h,随着时间的延长,生长抑制作用逐渐增强(n=3,P0.05)。CFZ对LP-1细胞具有生长抑制作用,并且随着药物浓度增加,抑制作用增强,IC50-1为8.45±0.76 nmol/L;以RSV预处理后的LP-1细胞为实验对象,给予不同浓度CFZ处理,IC50-2为为6.92±1.78 nmol/L。2流式细胞术测细胞周期结果得出:与对照组相比,RSV组在G0/G1期、S期细胞比例增高,CFZ组、RSV+CFZ组在S期、G2/M期细胞比例增高。与CFZ组相比,RSV+CFZ组在G2/M期细胞比例增高(P0.01)。3.流式细胞术测凋亡实验得出:对照组、RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组凋亡率(%)分别为9.07±2.60、11.63±4.70、42.50±2.31、74.93±5.01;CFZ组、RSV+CFZ组的凋亡率高于对照组、RSV组,且CFZ+RSV组的凋亡率高于CFZ组,差异具有明显统计学意义(P0.001)。4.流式细胞术测ROS实验得出:RSV组、CFZ组、RSV+CFZ组、3-MA组、3-MA+RSV+CFZ组、NAC组、NAC+RSV+CFZ组ROS水平为对照组的0.98±0.72、1.02±0.72、1.32±0.23、1.18±0.05、1.32±0.16、0.83±0.14、1.14±0.19倍;与对照组相比,RSV+CFZ组、3-MA+RSV+CFZ组ROS水平均升高(P0.05);与CFZ组相比,RSV+CFZ组ROS水平升高(P0.05);与RSV+CFZ组相比,NAC+RSV+CFZ组ROS水平降低,3-MA+RSV+CFZ组ROS水平升高,但均未有统计学差异,P值分别为0.128,0.998。5.自噬抑制剂预处理前后RSV+CFZ组凋亡率的变化:对照组、RSV+CFZ组、3-MA组、3-MA+RSV+CFZ组凋亡率(%)分别为10.37±3.41、77.10±2.98、9.63±0.32、90.13±8.24;3-MA+RSV+CFZ组的凋亡率高于CFZ+RSV,差异具有统计学意义(P0.01)。6 NAC预处理前后RSV+CFZ组凋亡率的变化:对照组、RSV+CFZ组、NAC组、NAC+RSV+CFZ组凋亡率(%)分别为8.03±1.36、69.67±1.59、8.87±0.90、63.70±1.64;RSV+CFZ组、NAC+RSV+CFZ组凋亡率均高于对照组及NAC组(P0.001);NAC+RSV+CFZ组的凋亡率低于CFZ+RSV组,差异具有统计学意义(P0.01)。7.WB实验证实RSV+CFZ组p38、smac、caspase 3表达升高,survivin、sirt-1表达减少,以及自噬相关蛋白LC3 I/II表达增高。加入自噬抑制剂后,3-MA+RSV+CFZ组LC3 I/II表达下降,caspase 3剪切体减少。与RSV+CFZ组相比,si RNA+RSV+CFZ组smac、Sirt-1表达水平下降,survivin表达未有明显变化。结论:RSV可增敏CFZ对MM细胞的杀伤作用,主要表现为生长抑制及促凋亡作用增强。首先,生长抑制作用增强可能是ROS/p38MAPK信号通路激活从而使G2/M周期阻滞增强来实现。其次,促凋亡作用可能是通过ROS/sirt-1及smac/survivin两条相互代偿的信号通路发挥作用。此外,两药联合作用产生保护性的自噬现象,阻断自噬可进一步增强RSV联合CFZ的促凋亡作用,因此,RSV、CFZ以及自噬抑制剂的联合应用为MM的临床治疗提供一定的实验基础。
【关键词】：多发性骨髓瘤 白藜芦醇 卡非佐米 凋亡 自噬
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.3
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-17
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-17
• 对象和方法17-37
• 1.1 材料、试剂、仪器17-22
• 1.1.1 细胞系17
• 1.1.2 主要实验试剂及耗材17-18
• 1.1.3 细胞培养耗材18-19
• 1.1.4 主要试剂缓冲液的配置19-22
• 1.2 实验方法22-37
• 1.2.1 操作前准备22
• 1.2.2 细胞培养22-24
• 1.2.3 MTT比色法测定RSV对MM细胞增殖的抑制率24-25
• 1.2.4 MTT实验检测RSV预处理前后CFZ对MM细胞的生长抑制作用25
• 1.2.5 流式细胞术测细胞周期实验检测RSV及RSV预处理前后CFZ对MM细胞细胞周期的影响25-26
• 1.2.6 流式测凋亡（FITC/PI）实验分别检测RSV、CFZ以及两药联合对MM细胞的促凋亡作用26-27
• 1.2.7 加入活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（ N-Acetylcysteine，NAC）及自噬抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3- methyl adenine，3-MA）后MM细胞内ROS的变化及凋亡率的变化27-29
• 1.2.8 蛋白质印迹法检测RSV预处理前后凋亡及自噬相关蛋白的表达水平29-36
• 1.2.9 统计学分析36-37
• 实验结果37-50
• 2.1 RSV抑制MM细胞的增殖37-39
• 2.2 RSV预处理前后CFZ对MM细胞增殖抑制作用及细胞周期的变化39-41
• 2.3 RSV预处理前后CFZ对MM细胞的促凋亡作用41-42
• 2.4 自噬抑制剂预处理前后RSV+CFZ组凋亡率的变化42-44
• 2.5 细胞内ROS变化及加入活性氧清除剂NAC后凋亡率的变化44-48
• 2.6 RSV预处理前后CFZ引起MM细胞后凋亡及自噬相关蛋白的表达情况48-50
• 讨论50-53
• 结论53-54
• 参考文献54-60
• 发表论文和参加科研情况说明60-61
• 综述 白藜芦醇与多发性骨髓瘤相关性的研究进展61-69
• 综述参考文献65-69
• 致谢69-71
• 个人简历71

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本文编号：933216