小白菊内酯与三氧化二砷联合诱导肝癌HepG2细胞及其肿瘤干细胞凋亡的研究

发布时间：2017-09-28 03:04

  本文关键词：小白菊内酯与三氧化二砷联合诱导肝癌HepG2细胞及其肿瘤干细胞凋亡的研究

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【摘要】：背景：肝癌(liver cancer)对化疗药物的低敏感性或不敏感性是阻碍临床治疗效果的主要因素,而肝癌干细胞(liver cancer stem cells, LCSCs)是肝癌发生、发展、耐药、转移和复发的根源。因此,探寻治疗肝癌或有效清除LCSCs的药物或措施是当前研究的热点。三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO或As203)可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤新生血管形成等发挥抗肿瘤作用,且具有杀伤肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的效应,在白血病和实体肿瘤的临床治疗中取得了良好的疗效。然而,ATO对实体肿瘤的治疗效果较白血病为差,且所需剂量较高常产生较大的毒副作用,使ATO在实体肿瘤的临床应用受到较大限制。因此,探寻ATO与其它药物的联合使用,降低ATO的毒副作用,增加肿瘤细胞对ATO的敏感性是提高ATO临床疗效的有效措施之一。小白菊内酯(Parthenolide, PTL)具有较强的抗肿瘤和抗CSCs活性以及对其它抗癌药物增敏效应。故探索PTL和ATO联用抗肝癌细胞及其清除LCSCs的作用具有重要的实用价值。目的：研究PTL和ATO联合对肝癌HepG2细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用以及对LCSCs的杀伤效应,并探讨其作用的分子机制。方法：采用MTT法检测细胞增殖活性；瑞氏-吉姆萨染色、光学显微镜观察细胞形态；电子显微镜观察细胞超微结构；集落形成法观察细胞自我更新能力；AnnexinV/PI双染检测细胞凋亡；流式细胞术检测细胞周期、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达、Caspase-3活性、细胞活性氧、线粒体膜电位以及细胞群体中LCSCs含量；流式细胞术结合干细胞免疫学标记CD 133+分选LCSCs;免疫印迹(Western Blotting)检测凋亡相关蛋白P53/p-P53、Bcl-2和NF-κB的表达；实时荧光定量RT-PCR检测bax、bcl-2、caspase-3、p53、nf-κb基因的表达水平。结果：1.肝癌HepG2细胞经不同浓度的PTL和ATO处理24h、48h和72h,二者均呈浓度、时间依赖性地抑制HepG2细胞的增殖,ATO的半数抑制浓度(IC50)分别为22.7μM、18.2μM和6.6μM; PTL为25.3μM、16.6pM和8.3μM。PTL与ATO联合应用,对HepG2细胞的增殖抑制作用较PTL和ATO单用显著增强。HepG2细胞集落形成实验获得类似的结果。提示：PTL与ATO联合可协同性地增强HepG2细胞对ATO的敏感性。2.PTL和ATO单独或联合诱导HepG2细胞后,细胞呈现体积缩小；细胞质致密；细胞核固缩、碎裂；染色质浓集或边集等典型凋亡形态学改变。细胞周期分布阻滞在G2/M期；Annexin V/PI染色显示：PTL和ATO联合作用后细胞凋亡率明显高于PTL和ATO单独作用,ATO或PTL单独作用时以早期凋亡为主,而联合作用则以晚期凋亡为主。实验结果证实：ATO与PTL联合的协同作用机制主要为诱导HepG2细胞的凋亡,PTL可增强肝癌HepG2细胞对ATO诱导凋亡的敏感性。3.ATO与PTL单独或联合作用后,HepG2细胞线粒体膜电位降低,bax基因mRNA及蛋白表达增高、bcl-2基因表达降低,Bax/Bc1-2比值明显增加；Caspase-3活性显著增高。PTL与ATO联合作用效应高于PTL或ATO单独作用。提示：ATO与PTL联合主要通过线粒体凋亡途径激活Caspase-3进而诱导HepG2细胞凋亡。4.经ATO和PTL单独或联合作用后,HepG2细胞P53的表达和磷酸化水平显著增强；细胞活性氧含量升高,NF-κB的表达显著受抑,ATO与PTL联合作用的效果远高于两药单独应用。推测P53可能通过增强Bax表达、抑制Bcl-2表达,促进线粒体膜去极化、释放凋亡因子等参与调节线粒体途径的细胞凋亡,而NF-κB不但能直接促进细胞的异常增殖,而且能抑制P53依赖的细胞的存活。据此提示：P53途径与NF-κB途径是ATO和PTL联合诱导肝癌HepG2细胞凋亡的额外调控途径。5.ATO和PTL单独或联合应用具有对肝癌干细胞(LCSCs)的杀伤效应,无论是在HepG2细胞群体中的LCSCs,还是分选纯化出来的LCSCs, ATO与PTL联合均对其具有协同性的杀伤效应,其作用机制可能为诱导LCSCs凋亡。结论：小白菊内酯和三氧化二砷联合协同性地抑制肝癌HepG2细胞增殖和诱导其凋亡,且可有效地杀伤肝癌干细胞；小白菊内酯和三氧化二砷主要通过线粒体途径、P53途径和NF-κB途径诱导肝癌HepG2细胞凋亡。
【关键词】：三氧化二砷 小白菊内酯 凋亡 肝癌 肿瘤干细胞
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 综述9-22
• 摘要9
• 1 三氧化二砷的抗肿瘤研究进展9-17
• 2 小白菊内酯诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展17-21
• 3 结束语21-22
• 引言22-25
• 材料与方法25-39
• 1 材料25-30
• 2 方法30-38
• 3 统计分析38-39
• 结果39-67
• 1 小白菊内酯联合三氧化二砷抑制HepG2细胞的增殖活性39-44
• 2 小白菊内酯联合三氧化二砷诱导肝癌HepG2细胞的凋亡44-50
• 3 小白菊内酯联合三氧化二砷诱导肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制50-62
• 4 小白菊内酯联合三氧化二砷诱导肝癌肿瘤干细胞凋亡62-67
• 讨论67-70
• 结论70-71
• 参考文献71-80
• 中英文缩略词表80-82
• 致谢82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王绩英;赵雪强;王昌明;莫碧文;蒋明;陈峰;;三氧化二砷通过抑制NF-κB增强TRAIL诱导A549细胞凋亡的作用研究[J];四川大学学报(医学版);2012年06期

2 唐俊;吴伟忠;;肿瘤干细胞与肿瘤转移[J];中国临床医学;2013年04期

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本文编号：933418