TLR7激动剂Loxoribine抑制肿瘤生长的免疫学机制研究

发布时间：2017-09-28 07:30

  本文关键词：TLR7激动剂Loxoribine抑制肿瘤生长的免疫学机制研究

  更多相关文章： TLR7 调节性T细胞 免疫抑制 抑瘤效应

【摘要】：目的:肿瘤局部存在多种类型的免疫抑制性细胞,其中调节性T细胞(regulatory T cell,Tregs)在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。Tregs在不同肿瘤中的表达都有不同程度的增高,诸如肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均发现有这群细胞的存在,肿瘤局部Tregs的数量与肿瘤的预后密切相关。Tregs通过多种机制诱导免疫抑制效应,是肿瘤免疫逃逸的重要调控因素,因此抑制Tregs的免疫抑制效应是免疫治疗的关键步骤。本课题通过CT26小鼠结肠癌和LLC Lewis小鼠肺癌模型,探讨了TLR7受体的激动剂Loxoribine抑制肿瘤生长的免疫学机制。方法:1)通过CT26小鼠结肠癌细胞和LLC lewis小鼠肺癌细胞构建荷瘤小鼠模型,模型构建成功后,以每只荷瘤小鼠1umol的Loxoribine进行腹腔注射,对照组注射PBS(9.8%DMSO),隔3天注射1次,持续3周。观察Loxoribine对小鼠体内肿瘤生长的影响。2)通过细胞增殖实验(CCK8)检测Loxoribine对CT26小鼠结肠癌细胞和LLC Lewis小鼠肺癌细胞是否有直接杀伤作用。3)通过RT-PCR检测TLR7在CT26小鼠结肠癌细胞和LLC Lewis小鼠肺癌细胞中是否表达。4)SCID小鼠是一种缺乏T淋巴细胞和B淋巴细胞的免疫缺陷小鼠,但先天免疫完整。为了明确Loxoribine是否通过激活先天免疫发挥抑制肿瘤的作用,进一步构建CT26小鼠结肠癌和LLC Lewis小鼠肺癌的SCID小鼠荷瘤模型,然后分别以Loxoribine和PBS(9.8%DMSO)进行腹腔注射,隔3天注射1次,持续3周。观察Loxoribine是否抑制体内肿瘤的生长,以明确Loxoribine是否通过激活先天免疫发挥抑制肿瘤生长的作用。5)通过磁珠分选(MACS)的方法分选出CT26小鼠结肠癌荷瘤小鼠、LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤小鼠以及对照小鼠脾脏、骨髓中CD4+T细胞,DCs和Tregs,通过淋巴细胞增殖实验检测Loxoribine处理后对淋巴细胞增殖的影响。6)通过MACS分选TLR7基因敲除小鼠(TLR7-/-)和对照组小鼠脾脏、骨髓中CD4+T细胞,DCs和Tregs,经Loxoribine刺激后检测其对淋巴细胞增殖的影响。7)通过流式细胞术检测Loxoribine对DCs成熟的影响。8)建立Transwell共培养体系(上层加入Tregs,下层加入DCs),在共培养体系中加入Loxoribine观察其对DCs细胞因子分泌的影响。9)使用ELISA方法对Loxoribine处理后的DCs进行细胞因子分泌量的检测并使用相应细胞因子的中和抗体进行中和,验证该细胞因子的作用。将Loxoribine处理后的DCs对小鼠静脉注射,观察其对小鼠肿瘤生长的抑制作用。结果:1)通过CT26小鼠结肠癌和LLC Lewis小鼠肺癌荷瘤模型发现,与PBS(9.8%DMSO)注射组相比,Loxoribine注射组小鼠皮下肿瘤生长显著缓慢,表明Loxoribine能够抑制肿瘤的体内生长。2)RT-PCR结果显示,CT26小鼠结肠癌细胞和LLC Lewis小鼠肺癌细胞中均不表达TLR7。通过细胞增殖实验(CCK8)发现,Loxoribine对CT26小鼠结肠癌细胞和LLC Lewis小鼠肺癌细胞无直接杀伤作用。3)通过SCID免疫缺陷小鼠荷瘤模型发现,Loxoribine处理组和对照组小鼠体内肿瘤生长无显著性差别,表明Loxoribine并不是通过激活先天性免疫而发挥抑制肿瘤生长的作用。4)通过MACS分选荷瘤组和对照组小鼠体内CD4+T细胞,DCs和Tregs,淋巴细胞增值实验结果显示,与未经Loxoribine处理的荷瘤小鼠和对照组小鼠相比,使用Loxoribine处理后的荷瘤小鼠体内Tregs不能抑制CD4+T细胞的增殖。5)淋巴细胞增殖实验发现,当CD4+T细胞,Tregs或DCs单独培养时,Loxoribine对其增殖没有直接影响;然而当CD4+T/DCs或Tregs/DCs混合培养,Loxoribine可以明显促进CD4+T细胞或Tregs的增殖,而对CD4+T/Tregs混合培养组细胞的增殖没有影响,表明TLR7的激动剂Loxoribine通过DCs促进CD4+T细胞和Tregs增殖。6)在CD4+T/DCs/Tregs的培养体系中加入Loxoribine发现,Loxoribine逆转Tregs对CD4+T细胞的抑制作用,而这一作用是通过DCs介导的。7)分选野生型和TLR7基因敲除小鼠体内CD4+T细胞、DCs和Tregs,通过淋巴细胞增殖实验发现,TLR7在DCs中的表达是Loxoribine促进CD4+T细胞增殖和逆转Tregs免疫抑制功能所必需的。8)流式细胞术分析结果显示Loxoribine对DCs上CD80、CD86等分子表达没有影响,表明Loxoribine不能诱导DCs的成熟。8)ELISA结果显示,Loxoribine可以促进DCs分泌多种细胞因子,其中IL-6表达变化最为明显,中和IL-6表达后可以显著抑制Loxoribine对CD4+T细胞和Tregs的作用,表明DCs通过分泌IL-6调控Tregs。9)将Loxoribine处理的DCs静脉注射荷瘤小鼠后,可以显著抑制肿瘤的生长。结论:Loxoribine能显著抑制CT26小鼠结肠癌细胞和LLC Lewis小鼠肺癌细胞在体内的生长,这种抑制效应并不是通过直接杀伤作用和激活先天性免疫而实现,而是通过DCs释放可溶性细胞因子IL-6促进CD4+T细胞的增殖并逆转Tregs的免疫抑制功能。
【关键词】：TLR7 调节性T细胞 免疫抑制 抑瘤效应
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 英文缩略语表12-14
• 绪论14-17
• 第一部分 Loxoribine抑制结肠癌和肺癌在体内的生长17-34
• 引言17-18
• 材料与方法18-26
• 结果26-31
• 讨论31-34
• 第二部分 Loxoribine通过DCs促进CD4+T细胞增殖和逆转Tregs的免疫抑制功能34-48
• 引言34
• 材料与方法34-39
• 结果39-45
• 讨论45-48
• 第三部分 Loxoribine通过DCs释放IL-6 来发挥作用48-61
• 引言48
• 材料与方法48-55
• 结果55-59
• 讨论59-61
• 结论61-62
• 参考文献62-68
• 致谢68-70
• 已发表文章70

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本文编号：934613