金属配合物的合成及其与人血清白蛋白相互作用的抗肿瘤活性的研究

发布时间：2017-09-28 10:11

  本文关键词：金属配合物的合成及其与人血清白蛋白相互作用的抗肿瘤活性的研究

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【摘要】：本文合成了两类金属配合物。第一类金属配合物是以希夫碱缩氨基硫脲为配体的铜金属配合物。第二类金属配合物是以白花丹素为配体,合成了两个还没有见报道的铜金属配合物。我们利用元素分析、红外光谱、质谱以及单晶x-射线衍射分析等技术对这些金属配合物的结构进行表征鉴定。在细胞水平上,利用MTT法、流式细胞仪检测法和荧光拍照等手段对这些金属配合物进行体外抗肿瘤活性的检测,以及其诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究。在分子水平上,利用蛋白免疫印记技术(Western Blot)检测这些金属配合物对凋亡相关蛋白以及周期相关蛋白表达情况的影响。本论文研究内容主要为以下几点：1.简要介绍肿瘤现状和抗癌药物的一些概况：概述了希夫碱缩氨基硫脲及其金属配合物的生物活性的研究进展；对人血清白蛋白(HSA)作为药物载体靶向治疗肿瘤的研究做了简单的介绍,并在此基础上简要的阐述了本论文的选题依据以及意义。2.铜(Ⅱ)配合物被认为是作为下一代金属抗癌药物的一个很有前景的候选药物,并被广泛研究。因此,本章合成了四个由希夫碱缩氨基硫脲(L1-L4)为配体的双核铜(Ⅱ)配合物,即[CuCl(L 1)]2 (C1), [CuNO_3(L2)]2 (C2), [Cu(NCS)(L3)]2 (C3)和[Cu(CH_3COO)(L4)]2 (C4)。用x-射线晶体衍射分析解析这四种配合物的晶体结构。通过MTT法、荧光显微镜观察拍照法、流式细胞仪检测法以及Western Blot研究了C1-C4配合物和C4-HSA复合物的抗肿瘤活性和作用机制。研究结果如下：(1)MTT法检测到Cu(Ⅱ)离子和配体(HL)对BEL-7404、A549、NCI-H460这几种癌细胞的作用效果并不好,但是C1-C4配合物对癌细胞具有较高的细胞毒性。比较配合物C1-C4,发现C4配合物的细胞毒性最强,而C1配合物的细胞毒性最弱。C4配合物是C2和C3配合物的两倍,而C2和C3配合物又是C1配合物毒性的两倍。C4配合物对上述三种癌细胞的ICso依次为0.486土0.010、0.507士0.021、0.235士0.010μm,当然,一旦它们与人血清白蛋白相互作用后,对肿瘤细胞的毒性会提高,相应的IC50会降低。(2)以人肝癌细胞BEL-7404为代表,我们研究了C1-C4配合物和C4-HSA复合物对肿瘤细胞的作用机制。本章利用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)荧光染色法和FITC Annexin V/PI双染检测法,表明上述配合物可以诱导细胞发生凋亡。利用JC-1染色实验、活性氧(ROS)检测实验、GSH/GSSG检测实验对C1-C4配合物以及C4-HSA复合物诱导BEL-7404细胞凋亡机制进行了研究。JC-1染色结果表明,上述几种物质刺激BEL-7404细胞后,用JC-1染色,发现细胞逐渐由发红色荧光转变为发绿色荧光,表明线粒体膜电位降低,说明癌细胞发生了凋亡。ROS和GSH/GSSG实验结果表明,相对于空白对照组而言,这几种物质使得细胞内ROS的水平提高了,GSH/GSSG的比值降低了,其中C1-C4这四种配合物中,C4配合物ROS水平最高,GSH/GSSG的比值最低,而C1配合物ROS水平提高得最小、GSH/GSSG的比值最大,这可能与这四种配合物上所带的官能团有关。 (3)采用Western Blot检测了C1-C4配合物以及C4与HSA相互作用后对BEL-7404细胞中的Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白以及caspase-9、caspase-3蛋白表达的影响,实验结果显示：抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达下调了,而促凋亡蛋白Bax的表达上调,导致Bax/Bcl-2的比值变大了,促使肿瘤细胞更容易发生凋1L=。此外,细胞色素C(Cyt-c)的释放促进了caspase家族蛋白的级联反应。上述实验结果证明了C1-C4配合物以及C4配合物和HSA相互作用后对细胞的抗肿瘤活性的机制是通过内源性线粒体介导的凋亡途径。3.以天然白花丹素为配体(PLN)合成了四个铜(Ⅱ)金属配合物,它们依次为[Cu(PLN)2]·2H_2O(C1); [Cu(PLN)(bipy)(H_2O)]NO_3·2H_2O(C2) [Cu(PLN)(Phen)]NO_3·0.25H_2O (C3); [Cu(PLN)(Phen)(Br)]CH_3OH (C4)。采用元素分析、红外光谱、质谱以及单晶x-射线衍射分析等技术对这些铜金属配合物的结构进行表征鉴定,发现这四种铜金属配合物(C1、C2、C3、C4)都是单核配合物。这些铜(Ⅱ)金属配合物结构的确定为后续的金属基药物抗肿瘤生物活性和作用机制的研究提供了物质基础和保障。叶酸(FA)修饰的HSA载体(FA-HSA)有望改善抗肿瘤药物的靶向性与药效。为了开发金属抗肿瘤药物的FA-HSA载体,我们研究了FA-HSA作为由天然白花丹素为配体衍生的铜(Ⅱ)金属配合物的载体的抗肿瘤活性和机制。荧光光谱和分子对接表明,Cu(Ⅱ)金属配合物结合到HSA的ⅡA亚结构域上。利用MTT法研究了这四个铜金属配合物在有无FA-HSA载体的条件下对人乳腺癌细胞(MCF-7)和人宫颈癌细胞(HeLa)这两种肿瘤细胞以及正常细胞的细胞毒性,结果表明,与单独的铜(Ⅱ)金属配合物作用于肿瘤细胞相比,在某种程度上,通过选择性的在肿瘤细胞中积累叶酸-人血清白蛋白-金属药物复合物,从而增强该复合物对叶酸阳性的肿瘤细胞的细胞毒性,但是没有提高对在体外的正常细胞(WI-38)的细胞毒性：利用流式细胞仪检测法,检测裸药C3和该裸药与载体的复合物,即叶酸-人血清白蛋白-金属药物复合物对HeLa周期的影响,结果显示,叶酸-人血清白蛋白-金属药物复合物对HeLa的G2/M期的细胞周期阻滞能力更强,并下调细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和细胞周期蛋白B1的表达水平。此外,叶酸-人血清白蛋白-金属药物复合物通过线粒体介导的内源性活性氧途径,并伴随着Bcl-2家族蛋白的调控来促进HeLa的凋亡。本文主要研究了两类金属配合物,我们的研究可能为未来开发新型抗癌金属配合物提供实验和理论基础以及通过合理设计人血清白蛋白载体开发金属抗癌药物的靶向性治疗。
【关键词】：人血清白蛋白 载体 抗肿瘤活性 周期 凋亡
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 第1章 前言11-17
• 1.1 引言11-12
• 1.2 缩氨基硫脲金属配合物抗肿瘤生物活性的研究概况12
• 1.3 铜以及铜金属配合物生物活性的研究12-13
• 1.4 人血清白蛋白作为药物载体的概述13-14
• 1.5 线粒体与细胞凋亡14-15
• 1.6 论文的选题依据及研究内容15-17
• 第2章 氨基硫脲希夫碱铜金属配合物的合成及其与人血清白蛋白相互作用的抗肿瘤活性与作用机制的研究17-40
• 2.1 引言17-18
• 2.2 实验材料18-19
• 2.2.1 主要仪器18
• 2.2.2 实验试剂18-19
• 2.2.3 细胞株19
• 2.3 实验方法19-30
• 2.3.1 金属配合物的合成和表征19-24
• 2.3.2 配合物对肿瘤细胞活性的初筛24-25
• 2.3.3 细胞调亡实验25-26
• 2.3.4 细胞内活性氧(ROS)的检测26
• 2.3.5 细胞内还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的检测26-27
• 2.3.6 Western blot检测27-30
• 2.4 实验结果与讨论30-39
• 2.4.1 配合物对肿瘤细胞的抑制率及IC_(50)值的测定30-32
• 2.4.2 细胞调亡分析32-35
• 2.4.3 细胞内活性氧的检测35-36
• 2.4.4 GSH/GSSG的检测36-37
• 2.4.5 蛋白质印记实验检测肿瘤细胞蛋白质表达水平37-39
• 2.5 本章小结39-40
• 第3章 叶酸官能化的人血清白蛋白作为由天然白花丹素衍生的抗癌铜(Ⅱ)复合物载体的抗肿瘤活性的研究40-65
• 3.1 引言40-41
• 3.2 实验部分41-51
• 3.2.1 实验仪器与试剂41
• 3.2.2 四个由天然白花丹素衍生的铜配合物的合成41-42
• 3.2.3 铜(Ⅱ)配合物的晶体结构测定42-44
• 3.2.4 叶酸-人血清白蛋白的合成44
• 3.2.5 叶酸-人血清白蛋白对Cu(Ⅱ)化合物的结合性质44-45
• 3.2.6 铜(Ⅱ)配合物抗癌活性45-46
• 3.2.7 铜(Ⅱ)配合物的抗癌机制46-50
• 3.2.8 叶酸-人血清白蛋白-金属药物配合物的靶向性50-51
• 3.3 结果和讨论51-63
• 3.3.1 叶酸-人血清白蛋白载体的表征51
• 3.3.2 由白花丹素衍生而来的两个Cu(Ⅱ)配合物的结构表征51-53
• 3.3.3 铜(Ⅱ)配合物在溶液中的状态53
• 3.3.4 铜配合物对叶酸-人血清白蛋白的结合53-56
• 3.3.5 叶酸-人血清白蛋白-金属药物配合物的抗肿癌活性56-58
• 3.3.6 叶酸-人血清白蛋白-金属药物复合物可能的抗癌机制58-63
• 3.3.7 叶酸-人血清白蛋白-金属药物复合物的靶向性63
• 3.4 本章小结63-65
• 第4章 总结与展望65-67
• 参考文献67-83
• 攻读硕士学位期间发表论文情况83-84
• 致谢84-85

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1 杨峰;梁宏;;人血清白蛋白及其复合物的结构基础[J];化学进展;2013年04期

2 叶剑雄,纪晓峰,王薇薇,何岿,葛忠良,郝崇;重组人血清白蛋白的表达[J];上海医药;2000年11期

3 李玉珍,刘学涌,陈晓凯,常昆;两亲磁性高分子微球与人血清白蛋白的相互作用[J];中国药学杂志;2004年09期

4 曹q，

本文编号：935242