Icotinib耐药NSCLC细胞株的建立及其耐药机制研究

发布时间：2017-09-29 10:14

  本文关键词：Icotinib耐药NSCLC细胞株的建立及其耐药机制研究

  更多相关文章： 非小细胞肺癌 EGFR 埃克替尼 耐药 代谢组学 谷氨酸 c-Met

【摘要】：目的：近年来,随着肿瘤个体化靶向治疗的迅速发展,以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)在EGFR阳性突变的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者中疗效显著。但随着用药时间的延长(12-14个月),患者最终对其产生耐药性,病情复发或进展。研究发现,EGFR-TKI潜在的耐药机制是复杂和多样的,涉及靶蛋白的改变或EGFR的T790M继发突变、EGFR下游通路中PI3K、KRAS、BRAF等基因突变、c-Met扩增或HGF过表达、发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和向小细胞类型转化(small cell lung cancer, SCLC)等,但是还有20-30%的耐药机制不明确,可能与表观遗传学、代谢异常等有关。肿瘤的发生和进展都会产生大量的代谢物变化,所以肿瘤也是一种代谢性疾病。利用代谢组学的方法寻找亲本细胞和耐药细胞之间差异的代谢物,有助于了解耐药发生的机制,寻找新的潜在药物靶点。方法：本研究中我们选用三种不同的NSCLC细胞株A549 (EGFR野生型)、PC-9 (EGFR敏感突变型)和H1975 (EGFR T790M继发突变型),DNA直接测序法检测A549、PC-9和H1975的EGFR突变状态；采用国产的EGFR- TKI (埃克替尼,icotinib)在体外以小剂量浓度梯度递增法诱导建立埃克替尼耐药株A549/IR、PC-9/IR和H1975/IR。从不同角度对耐药株进行鉴定：3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)检测PC-9/IR的耐药性及耐药稳定性;光镜下观察其形态学变化；DNA测序法检测EGFR的T790M状态;应用Real-time PCR和Western blot检测EGFR及其旁路信号相关分子的表达：小鼠移植瘤模型检测PC-9/IR耐药细胞在体内的增殖能力。分别收集亲本细胞和耐药细胞利用核磁共振分析技术手段分析亲本细胞和耐药细胞的差异代谢物,通过主成分分析(principal component analysis, PCA)和偏最小二乘法-判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)分析得出载荷图和VIP (variable importance in projection, VIP)图,找到区分亲本细胞和耐药细胞贡献最大的代谢物。通过对差异代谢物代谢通路的分析推测可能的药物作用靶点,并检测针对此靶点的抑制剂对PC-9/IR耐药细胞生长和增殖的影响,以及与此靶点相关的蛋白质在PC-9/IR耐药细胞中的表达情况。结果：历时近8个月获得埃克替尼耐药株A549/IR (A549/Icotinib resistant)和H1975/IR,近6个月获得PC-9/IR耐药细胞。MTT法检测到A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR对埃克替尼耐药,且PC-9/IR耐药细胞的半数抑制浓度(50% inhibiting concentration, IC50)是21.49μmol/L,高于PC-9亲本细胞的IC50值1.32μmol/L,达到高度耐药状态；A549/IR耐药细胞的IC50为173.73μmol/L,高于A549亲本细胞的IC50值17.46μmol/L;H1975/IR耐药细胞的IC50为196.73μmol/L,高于H1975亲本细胞的IC50值23.93μmol/L。对PC-9/IR耐药的稳定性检测发现在2μmol/L埃克替尼中持续培养PC-9/IR 4个月,其耐药性依然稳定；PC-9/IR耐药细胞未发生T790M继发突变。PC-9/IR耐药细胞中EGFR、PI3K、AKT、STAT3和c-Met的表达水平较亲本株高,分别为12.09、5.73、3.72、7.44和5.31倍；埃克替尼不能抑制PC-9/IR耐药细胞中AKT和STAT3的活化且多药耐药蛋白ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)在PC-9/IR耐药细胞中表达量升高：结合c-Met及下游分子在PC-9/IR耐药细胞中表达升高且利用c-Met抑制剂(克唑替尼,crizotinib)可以抑制PC-9/IR耐药细胞体外、体内的增殖,提示PC-9/IR耐药细胞发生了c-Met旁路活化。核磁共振分析技术得到A549/IR、H1975/IR、PC-9/IR和A549、PC-9、H1975的代谢指纹图谱,分析6大类包括氨基酸及衍生物、有机酸类、糖类、醇类、核苷酸组分等共62种代谢物的浓度。运用PCA主成分分析和PLS-DA多元统计分析得到亲本细胞和耐药细胞代谢轮廓相异,并分别得出VIP值大于1的15种区分亲本细胞和耐药细胞代谢差异的代谢物。三种不同EGFR状态的细胞系,筛选得到的区分亲本细胞和耐药细胞的差异代谢物不完全相同：区分PC-9细胞和PC-9/IR耐药细胞的标志差异代谢物是谷氨酸,醋酸盐、尿酸、胆碱和丙氨酸；区分A549和A549/IR细胞的差异代谢物是谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、天冬氨酸和谷胱甘肽;区分H1975细胞和H1975/IR耐药细胞的差异代谢物是乳酸、谷氨酸、牛磺酸、醋酸盐和脯氨酸。PC-9/IR耐药细胞的生长对谷氨酰胺存在浓度依赖性,促进谷氨酰胺酶表达的c-Myc基因在PC-9/IR耐药细胞中表达升高且埃克替尼不能抑制c-Myc在PC-9/IR耐药细胞中表达。谷氨酰胺酶抑制剂Compound 968可以抑制PC-9/IR耐药细胞在体外的增殖。结论：成功建立了A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR三株耐药细胞。研究结果提示PC-9/IR的耐药与c-Met活化、ABCG2表达升高及代谢变化有关。谷氨酰胺代谢通路是潜在的药物靶点,初步的研究结果提示谷氨酰胺酶抑制剂可以抑制PC-9/IR的增殖且存在剂量依赖性。
【关键词】：非小细胞肺癌 EGFR 埃克替尼 耐药 代谢组学 谷氨酸 c-Met
【学位授予单位】：北京交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 1 背景介绍15-29
• 1.1 前言15
• 1.2 EGFR的结构和功能15-16
• 1.3 EGFR突变状态和EGFR-TKI的作用机制16-17
• 1.4 EGFR-TKI的耐药机制17-22
• 1.4.1 原发性耐药机制17-18
• 1.4.2 获得性耐药机制18-22
• 1.5 肿瘤与代谢22-26
• 1.5.1 “Warburg效应”学说22-23
• 1.5.2 肿瘤细胞代谢特点—有氧糖酵解23-24
• 1.5.3 肿瘤细胞代谢另一特点—消耗大量谷氨酰胺24-25
• 1.5.4 抑制能量代谢杀灭肿瘤细胞25-26
• 1.6 代谢组学及其应用26-27
• 1.7 本研究目的和意义27-29
• 2 实验材料29-35
• 2.1 细胞系29
• 2.2 实验动物29
• 2.3 药品29
• 2.4 主要试剂29-30
• 2.5 主要仪器设备30-31
• 2.6 主要缓冲液配制31-35
• 3 实验方法35-51
• 3.1 细胞培养35
• 3.2 EGFR突变状态的检测35-38
• 3.2.1 细胞中基因组DNA提取36
• 3.2.2 DNA定量36
• 3.2.3 PCR扩增36-38
• 3.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测38
• 3.2.5 测序38
• 3.3 耐药细胞株的建立38-40
• 3.3.1 MTT法检测埃克替尼对细胞活性的影响38-39
• 3.3.2 埃克替尼对细胞克隆形成能力的检测39
• 3.3.3 检测埃克替尼对细胞凋亡的影响39
• 3.3.4 耐药细胞株的诱导39-40
• 3.4 耐药细胞株的鉴定40-47
• 3.4.1 耐药细胞株耐药指数的测定40
• 3.4.2 耐药稳定性的检测40
• 3.4.3 耐药细胞株形态学的观察40
• 3.4.4 EGFR T790M突变状态检测40-41
• 3.4.5 Real-time PCR检测EGFR及其旁路信号相关分子表达41-43
• 3.4.6 Western blot检测EGFR及其旁路信号相关分子磷酸化及总蛋白表达43-46
• 3.4.7 PC-9/IR耐药细胞株皮下移植瘤模型的建立46-47
• 3.5 不同细胞株代谢差异物的分析47-49
• 3.5.1 样本收集47
• 3.5.2 样本制备47-48
• 3.5.3 采集核磁数据参数48-49
• 3.5.4 核磁数据处理49
• 3.6 谷氨酰胺酶抑制剂对PC-9/IR耐药细胞的影响49-50
• 3.6.1 谷氨酰胺对PC-9/IR耐药细胞的影响49-50
• 3.6.2 Western Blot检测PC-9/IR耐药细胞中谷氨酰胺相关蛋白表达50
• 3.6.3 Compound 968与埃克替尼联用对PC-9/IR耐药细胞的影响50
• 3.7 统计学处理50-51
• 4 实验结果51-79
• 4.1 A549,H1975和PC-9细胞EGFR突变状态的检测51-52
• 4.1.1 EGFR18、19、20、21外显子PCR扩增51
• 4.1.2 直接测序法-检测EGFR基因突变的结果51-52
• 4.2 耐药细胞株的建立52-56
• 4.2.1 埃克替尼对不同EGFR突变状态细胞生长的影响52-53
• 4.2.2 埃克替尼对PC-9细胞克隆能力形成的影响53-54
• 4.2.3 埃克替尼对PC-9细胞凋亡的影响54-56
• 4.3 耐药细胞株的鉴定56-61
• 4.3.1 MTT法测耐药细胞的耐药性56-57
• 4.3.2 耐药细胞株稳定性的测定57
• 4.3.3 耐药细胞的形态学观察57-58
• 4.3.4 EGFR T790M突变检测58-59
• 4.3.5c-Met过表达的检测59-60
• 4.3.6 PC-9/IR耐药株小鼠移植瘤模型的建立及其体外、内增殖能力的检测60-61
• 4.4 NMR检测亲本细胞和耐药细胞代谢物差异61-74
• 4.4.1 代谢轮廓归属谱图61-62
• 4.4.2 代谢物种类与浓度62-65
• 4.4.3 多变量统计学分析65-74
• 4.5 PC-9/IR耐药细胞生长对谷氨酰胺存在依赖性74-79
• 4.5.1 谷氨酰胺酶抑制剂抑制PC-9/IR耐药细胞的增殖74-76
• 4.5.2 C-MYC在PC-9/IR耐药细胞中的表达情况76-79
• 5 讨论79-83
• 6 结论83-85
• 参考文献85-91
• 附录 A91-93
• 作者简历及攻读硕士学位期间取得的研究成果93-97
• 学位论文数据集97

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 王少东,张振书,张杏泉,周殿元;CPP32在耐药细胞中的活性及其意义[J];肿瘤;2002年02期

2 王少东,张振书,张杏泉,周殿元;CPP32在耐药细胞及药敏肿瘤细胞中的表达及其意义[J];第一军医大学学报;2002年01期

3 李冬梅;王志敏;;防己水煮液逆转MCF-7/ADM多药耐药细胞的初步研究[J];中国野生植物资源;2006年04期

4 张海涛;伍俊;汪亚君;郭黠;;鲎素抑制多药耐药细胞HL-60/VCR生长的研究[J];肿瘤;2007年08期

5 陈俊,张积仁,周殿元;乳腺癌MCF-7/Adr耐药细胞CD95分子的多态性表达和功能缺陷[J];癌症;2000年04期

6 王少东;张振书;张杏泉;周殿元;;CPP32在阿霉素诱导的胃癌耐药细胞的凋亡[J];世界华人消化杂志;2001年10期

7 董光辉;罗璇;翟溯澜;李萍;王雪融;;哌立福辛通过激活GSK3β抑制雷帕霉素耐药细胞的生长[J];中国临床药理学与治疗学;2011年04期

8 祁明芳,魏素芳,汪明春,齐静,杨纯正;rhG-CSF对K562／A02多药耐药细胞增殖的影响[J];中华血液学杂志;1996年07期

9 陆燕蓉,林苹,张洁,王修杰,黄孝忠,宁其志;Lewis肺癌耐药细胞的诱导及其耐药性的初步研究[J];中国肺癌杂志;2002年03期

10 刘超;NK及LAK细胞对多药耐药细胞的杀伤作用[J];国外医学.输血及血液学分册;1994年06期

中国重要会议论文全文数据库 前8条

1 郑波慧;龚玉萍;廖小梅;;硼替佐咪对Pgp阳性耐药细胞的作用研究[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

2 龚玉萍;叶雪石;刘霆;顾玲;;mdr1转基因单因素耐药和药物诱导的多因素耐药的比较研究[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年

3 王玮;傅建新;薛永权;岑建农;姚利;陈子兴;;MDR1/P-gp介导的多药耐药细胞的凋亡实验研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

4 朱逢佳;王以;魏群;曾苏;Xiaoyun Fu;王林波;曹江;;多药耐药细胞K562/ADR中Annexin-I和EF-Tu的表达变化(英文)[A];浙江省免疫学会第六次学术研讨会论文汇编[C];2007年

5 郑世营;葛锦峰;赵军;邵峰;纪勇;;Caspase-3在阿霉素诱导的食管癌耐药细胞的凋亡的作用[A];第八届华东六省一市胸心血管外科学术会议论文汇编[C];2005年

6 郑世营;葛锦峰;赵军;邵峰;纪勇;;Caspase-3在阿霉素诱导的食管癌耐药细胞的凋亡的作用[A];中华医学会第六次全国胸心血管外科学术会议论文集（胸外科分册）[C];2006年

7 陈英玉;郑合勇;胡建达;郑志宏;郑静;连晓岚;吕联煌;;大黄素抑制HL-60/ADR耐药细胞增殖和诱导凋亡的作用[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年

8 黄昊;吴健;王旭;章程;寿成超;;胃癌耐药细胞系的建立及特异性抗耐药细胞单克隆抗体的制备[A];中国病理生理学会第十三届肿瘤、第十四届免疫专业委员会学术会议论文集[C];2012年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 王少东;胃癌耐药细胞的生物学特性及凋亡相关分子的表达[D];第一军医大学;2002年

中国硕士学位论文全文数据库 前5条

1 李雪;Icotinib耐药NSCLC细胞株的建立及其耐药机制研究[D];北京交通大学;2016年

2 袁犁;PI3K特异性抑制剂对卵巢癌紫杉醇耐药细胞逆转耐药作用机制的研究[D];重庆医科大学;2012年

3 张瑞清;扶正消瘤颗粒抗MCF-7耐药细胞体外增殖及机理研究[D];南方医科大学;2011年

4 孙永梅;miRNA 200c对A549/MTX耐药细胞迁移和侵袭作用的研究[D];山东大学;2015年

5 王颖颖;RNA干扰技术抑制卵巢癌耐药细胞裸鼠移植瘤多药耐药性的研究[D];山东大学;2007年

，

本文编号：941420