shRNA LKB1慢病毒载体构建、转染和表达的研究

发布时间：2017-09-30 00:28

  本文关键词：shRNA LKB1慢病毒载体构建、转染和表达的研究

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【摘要】：目的:构建针对人LKB1(liver kinase B1,或STK11 serine/threonine protein kinase11)基因的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的慢病毒载体,并观察转染人肝癌细胞Huh7后对LKB1 mRNA和蛋白的表达。方法:根据人LKB1的基因信息,设计3条针对LKB1基因cds区的si RNA序列,同时设计1条negative序列用于RNAi阴性对照(Negative Control,NC),组建与shRNA相对应的4对互补的单链DNA。将合成的序列插入空载体GV115(元件顺序为:hU6-MCS-CMV-EGFP)中,重组获得慢病毒载体。进行测序鉴定后,再转染293T细胞产生病毒液,得到的病毒液再转染肝癌细胞株Huh7。荧光显微镜观察转染后细胞的情况,实时荧光定量PCR检测转染后细胞LKB1 mRNA的表达情况,Western印迹法检测转染后细胞LKB1蛋白的表达情况。结果:成功构建含shRNA LKB1的慢病毒载体,人肝癌细胞株Huh7转染后LKB1mRNA和蛋白表达显著下调。结合感染后的细胞照片,判定shRNA LKB1-2(KD2)组为有效靶点组。结论:成功获得阻断人肝癌细胞株Huh7 LKB1表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体,人肝癌细胞株Huh7转染后LKB1 mRNA和蛋白表达显著下调,为后期研究提供了实验基础。
【关键词】：shRNA LKB1 人肝癌细胞
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 中英文缩略词表8-9
• 第1章 引言9-10
• 第2章 材料与方法10-22
• 2.1 菌株及细胞株、主要实验试剂及仪器等10-16
• 2.1.1 菌株及细胞株10
• 2.1.2 主要试剂10-11
• 2.1.3 主要试剂的配制11-14
• 2.1.4 主要仪器、材料14-15
• 2.1.5 载体信息15-16
• 2.2 慢病毒载体的构建16-17
• 2.2.1 LKB1干扰序列的设计16
• 2.2.2 克隆制备与鉴定16
• 2.2.3 慢病毒的包装与滴度检测16-17
• 2.3 慢病毒感染细胞17-19
• 2.3.1 准备目的细胞17
• 2.3.2 目的细胞慢病毒感染预实验17-18
• 2.3.3 目的细胞慢病毒转染18-19
• 2.4 PCR检测细胞LKB1的MRNA水平19
• 2.5 WESTERN BLOT检测细胞LKB1蛋白的表达水平19-21
• 2.6 统计处理21-22
• 第3章 结果22-26
• 3.1 慢病毒感染后细胞图片22
• 3.2 REAL-TIME PCR检测感染效果22-25
• 3.3 WESTERN BLOT检测蛋白表达水平25-26
• 第4章 讨论26-29
• 第5章 结论与展望29-30
• 致谢30-31
• 参考文献31-34
• 攻读学位期间的研究成果34-35
• 综述35-42
• 参考文献40-42

【参考文献】

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1 周小智;薛耀明;高方;朱波;关美萍;;二甲双胍对AGEs诱导人结肠癌细胞SW-480增殖作用的影响及机制的初探[J];中国糖尿病杂志;2012年07期

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本文编号：945134