基于Skp2为靶点的抗肿瘤多肽药物的筛选

发布时间：2017-09-30 07:48

  本文关键词：基于Skp2为靶点的抗肿瘤多肽药物的筛选

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【摘要】：目的:恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病。目前临床抗肿瘤药物常常有疗效不佳,毒副反应较大的特点。抗肿瘤肽类药物或蛋白类药物与传统小分子药物相比有其独特的优势:能特异性地有效干扰靶蛋白的作用和功能,毒副反应轻,研发成本相对较低。Skp2是一调节细胞周期的激酶相关蛋白,它通过对多种靶蛋白的泛素化降解作用而参与细胞周期的调控,其功能的改变与肿瘤的发生、发展及预后密切相关。因此,本文拟以Skp2为靶点,采用酵母双杂交技术对我们已构建好的人源化肽适配体文库进行筛选,旨在寻找有效的抗肿瘤肽类药物。方法和结果:1.多肽适配体文库的筛选:以人Skp2蛋白的LRR区(208aa-390aa)为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统对人源化多肽适配体文库进行筛选。我们首先筛选到特异性结合Skp2的肽适配体一百多个,经质粒提取测序后,确定了11个正确编码的多肽用于后期实验。2.检测多肽适配体的抗肿瘤效应:首先分别检测胃癌细胞系(AGS、MKN28、MKN45、SGC7901)、乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231)、肺癌细胞系(H23、H1299、A549、H292、SPC-A1)以及神经胶质瘤细胞系(H4、SH-SY5Y、SK-N-SH、U251)的Skp2及其底物的蛋白和mRNA表达水平,然后将Skp2表达量相对较高且其底物表达量相对较低的细胞株用于后续检测多肽适配体的抗肿瘤作用。结果表明,肺癌细胞株A549符合这一要求。3.多肽适配体与Skp2相互作用的验证:将通过酵母双杂交筛选得到的多肽适配体亚克隆到带His标签的表达载体上,体外NI-柱纯化蛋白。构建带GST标签的Skp2表达载体,并纯化蛋白,然后在体外与纯化的肽适配体进行GST pull-down实验,确定其与Skp2之间的体外作用关系。4.快速筛选有抑癌作用的肽适配体:将肽适配体构建到真核表达载体,转染入肿瘤细胞,通过CCK8法检测细胞存活率,软琼脂克隆形成实验检测细胞非锚定生长增殖能力以探查肽适配体对肿瘤细胞生长增殖的影响;流式细胞术分别检测细胞周期和凋亡,分析多肽对细胞周期的影响;Western Blot检测Skp2及其底物的变化。结果表明,采用真核细胞表达系统,观察到11个多肽适配体蛋白中的3个多肽蛋白(即小分子多肽6-1、8-1和23-5)可有效地抑制Skp2对其底物p27或p21的降解。功能实验结果也显示,上述3个多肽适配体蛋白能有效地抑制肿瘤的生长。结论:我们以人Skp2蛋白的LRR区为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统对人源化多肽适配体文库进行筛选,并成功地筛选出3个多肽蛋白(即小分子多肽6-1、8-1和23-5)可有效地抑制Skp2对其底物p27或p21的降解及明显抑制肿瘤生长,提示这些多肽蛋白有望进一步开发出可能的新的抗肿瘤药物。
【关键词】：Skp2 肽适配体 抗肿瘤 药物
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.53
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 绪论11-16
• 1.1 研究背景11
• 1.2 Skp2与肿瘤11-16
• 1.2.1 Skp2结构与功能11-14
• 1.2.2 小分子多肽14-15
• 1.2.3 Skp2的多种底物15-16
• 第2章 主要方法和设计流程16-35
• 2.1 引言16
• 2.2 主要方法16-31
• 2.2.1 酵母双杂交16-17
• 2.2.2 分子克隆17-18
• 2.2.3 Gel Extraction（OMEGA试剂盒）18-19
• 2.2.4 转化19-20
• 2.2.5 小分子多肽基因合成20-21
• 2.2.6 反转录（TAKARA试剂盒）21
• 2.2.7 Q-PCR21-22
• 2.2.8 琼脂糖凝胶电泳22-23
• 2.2.9 凝胶成像系统分析23
• 2.2.10 Plasmid Isolation（OMEGA小提试剂盒）23
• 2.2.11 Plasmid Isolation（TIANGEN大提试剂盒）23-24
• 2.2.12 RNA提取（Trizol提取法）24-25
• 2.2.13 Superfectin Transfection （普飞生物）25
• 2.2.14 磷酸钙转染25-26
• 2.2.15 PEI Transfection26
• 2.2.16 Western Blot26-28
• 2.2.17 超声破碎28-29
• 2.2.18 NI-柱纯化29
• 2.2.19透析29
• 2.2.20 BCA蛋白定量29-30
• 2.2.21 PI染色细胞周期30
• 2.2.22 MTT细胞增殖实验30-31
• 2.2.23 GST-pull down实验31
• 2.3 试剂及设备31-34
• 2.3.1 实验试剂31-33
• 2.3.2 实验仪器设备33-34
• 2.4 设计流程34-35
• 第3章 实验结果35-55
• 3.1 引言35
• 3.2 酵母双杂交35-36
• 3.3 小分子多肽构建及纯化36-40
• 3.3.1 多肽适配体及支架蛋白的原核表达载体的构建36-39
• 3.3.2 多肽适配体的IPTG诱导表达及纯化39-40
• 3.4 体外相互作用机制研究40-42
• 3.4.1 GST标签及标签蛋白Skp2的构建及诱导表达40-41
• 3.4.2 GST-pull down实验体外验证多肽和Skp2之间相互作用41-42
• 3.5 肿瘤细胞系的筛选42-46
• 3.5.1 肺癌细胞系Skp2和底物的mRNA和蛋白水平42-44
• 3.5.2 胃癌、乳腺癌细胞系Skp2和底物的mRNA和蛋白水平44-45
• 3.5.3 神经胶质瘤细胞系Skp2和底物的mRNA和蛋白水平45-46
• 3.5.4 细胞系的确定46
• 3.6 功能多肽的筛选46-51
• 3.6.1 纯化蛋白浓度的测定46-47
• 3.6.2 多肽适配体给药47
• 3.6.3 A549细胞转染方法的确定47-48
• 3.6.4 A549细胞系中转染多肽后Skp2底物蛋白变化48-49
• 3.6.5 HeLa转染方法筛选49-50
• 3.6.6 HeLa细胞系中梯度转染多肽后Skp2底物蛋白变化50-51
• 3.7 功能验证51-54
• 3.7.1 多肽适配体 6-1、8-1 和 23-5 对细胞周期的影响51-53
• 3.7.2 多肽适配体 6-1、8-1 和 23-5 影响细胞增殖实验53-54
• 3.8 结论54-55
• 第4章 讨论与展望55-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-61
• 综述61-70
• 参考文献65-70

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