抑癌基因甲基化在食管鳞癌细胞株中的表达差异及其与DNMT1的关系

发布时间：2017-10-01 15:11

  本文关键词：抑癌基因甲基化在食管鳞癌细胞株中的表达差异及其与DNMT1的关系

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【摘要】：目的:应用靶向DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因的短发夹RNA(shRNA)重组质粒来转染体外培养的食管鳞癌细胞,并建立裸鼠的动物移植瘤模型,研究其对食管鳞癌细胞增殖、转移和侵袭的影响。方法:1.实验组予以shRNA-DNMT1序列进行转染,对照组仅予以shRNA-NC阴性对照序列,构建沉默DNMT1基因的重组慢病毒并感染食管鳞癌细胞后获得稳定细胞株,建立裸鼠的动物移植瘤模型。2.cell counting kit 8(CCK-8)检测细胞增殖生长能力。3.集落形成实验检测细胞形成集落的能力。4.Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭和转移能力。5.流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡与周期。6.实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤组织中抑癌基因P16、CDH13、RASSF1A、APC、MGMT、ASC、DAPK和DNMT1的mRNA表达。7.甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)检测食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤组织中抑癌基因RASSF1A和DAPK的甲基化状态。8.Western blot检测食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤组织中抑癌基因RASSF1A和DAPK所调控的蛋白和DNMT1蛋白的表达。9.免疫组化检测裸鼠移植瘤组织中RASSF1A和DAPK蛋白的表达。结果:1.成功构建沉默DNMT1基因的重组慢病毒并感染食管鳞癌细胞,获得稳定细胞株。2.与对照组比较,qRT-PCR结果表明食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤中实验组DNMT1的mRNA表达明显减少,而RASSF1A和DAPK的mRNA表达明显增多(P0.01)。3.Western blot表明食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤中实验组DNMT1蛋白水平明显降低,而RASSF1A和DAPK所表达的蛋白水平明显增多(P0.05)。4.CCK检测表明实验组中细胞增殖速度明显减慢(P0.05)。5.集落形成实验表明实验组中细胞的集落数明显减少(P0.01)。6.Transwell实验表明实验组中食管鳞癌细胞的侵袭和转移能力明显减弱(P0.01)。7.流式细胞仪检测结果显示:与对照组相比实验组食管癌细胞的凋亡细胞百分比增高(P0.01),集中在早调阶段;与对照组相比,实验组食管癌细胞呈现以下改变:DNA合成前期(G0/G1期)细胞的百分比增高(P0.001),DNA合成期(S期)细胞的百分比减少(P0.001),DNA合成后期(G2/M期)细胞的百分比减少(P0.001)。8.免疫组化表明裸鼠移植瘤中实验组RASSF1A和DAPK蛋白表达明显增多(P0.05)。9.甲基化特异性PCR(MSP)表明食管鳞癌细胞和裸鼠移植瘤中实验组RASSF1A和DAPK的甲基化受到抑制。结论:沉默DNMT1可以通过调节RASSF1A和DAPK基因甲基化的途径从而抑制食管鳞癌细胞的增殖,转移和侵袭。
【关键词】：食管鳞状细胞癌 甲基化 DNMT1 抑癌基因
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 英汉缩略词对照表12-13
• 前言13-16
• 第一部分 稳定转染细胞株的建立16-37
• 1 材料与方法16-28
• 1.1 实验材料与仪器16
• 1.2 主要实验试剂16-18
• 1.3 主要实验仪器18
• 1.4 实验方法18-28
• 2 结果28-31
• 2.1 DNMT1沉默载体转染效率的确定28
• 2.2 稳定沉默细胞的DNMT1m RNA表达检测28-30
• 2.3 稳定沉默细胞的DNMT1蛋白表达检测30-31
• 3 讨论31-33
• 4 结论33-34
• 参考文献34-37
• 第二部分 DNMT1对食管鳞癌影响的体外实验37-63
• 1 材料与方法37-45
• 1.1 实验材料与仪器37
• 1.2 主要实验试剂37-38
• 1.3 主要实验仪器38
• 1.4 实验方法38-45
• 2 结果45-56
• 2.1 CCK-8 法检测食管鳞癌细胞增殖情况45
• 2.2 集落形成实验45-46
• 2.3 Transwell迁移实验46-47
• 2.4 Transwell侵袭实验47-48
• 2.5 细胞周期48-49
• 2.6 细胞凋亡49-50
• 2.7 肿瘤相关抑癌基因m RNA表达的检测50-54
• 2.8 肿瘤相关抑癌基因蛋白表达的检测54-55
• 2.9 肿瘤相关抑癌基因DAPK和RASSF1A甲基化的检测55-56
• 3 讨论56-58
• 4 结论58-59
• 参考文献59-63
• 第三部分 沉默DNMT1对裸鼠移植瘤生长的影响63-79
• 1 材料与方法63-69
• 1.1 实验材料与仪器63
• 1.2 主要实验试剂63-65
• 1.3 主要实验仪器65
• 1.4 实验方法65-69
• 2 结果69-75
• 2.1 裸鼠体内移植瘤的生长情况69-70
• 2.2 裸鼠肿瘤组织中DNMT1和抑癌基因DAPK、RASSF1A的表达70-73
• 2.3 免疫组化检测裸鼠移植瘤组织中抑癌基因DAPK和RASSF1A的表达73
• 2.4 甲基化特异性PCR检测裸鼠移植瘤组织中抑癌基因DAPK和RASSF1A的甲基化状态73-75
• 3 讨论75-77
• 4 结论77-78
• 参考文献78-79
• 全文总结79-80
• 综述80-92
• 参考文献86-92
• 攻读学位期间发表的学术论文目录92-93
• 致谢93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 靳义;刘俊峰;;基因甲基化与去甲基化在食管癌中的研究进展[J];食管外科电子杂志;2013年04期

2 章金强;刘季春;;E-钙黏附素基因甲基化及蛋白的表达在食管癌中的研究进展[J];南昌大学学报(医学版);2012年01期

3 张江兰;杨燕君;张晓丽;;DNA甲基化与食管癌关系研究进展[J];河北北方学院学报(自然科学版);2011年02期

4 ;Circulating microRNAs: Novel biomarkers for esophageal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2010年19期

5 王巍伟;李锋;;食管癌相关基因甲基化研究进展[J];临床与实验病理学杂志;2009年06期

6 宋长山;谭家驹;崔金环;徐致祥;杨光;司建华;;食管鳞癌中p16基因启动子区甲基化及其表达[J];肿瘤防治研究;2008年01期

7 丁士刚;吴笛;邹检平;邢秀娟;鲁凤民;陈香梅;;食管鳞癌RASSF1A基因启动子区甲基化研究[J];中国微创外科杂志;2007年12期

8 张功员;刘秋亮;乐晓萍;丁一;张钦宪;;食管癌组织hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化[J];第四军医大学学报;2007年11期

9 宋长山;杨光;谭家驹;;DNA甲基化与食管癌的关系[J];中华肿瘤防治杂志;2007年01期

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本文编号：954136