核酸适配体修饰的纳米颗粒在肿瘤靶向免疫治疗及靶向热疗中的应用

发布时间：2017-10-01 18:15

  本文关键词：核酸适配体修饰的纳米颗粒在肿瘤靶向免疫治疗及靶向热疗中的应用

  更多相关文章： MUC1 CD16 纳米材料 核酸适配体 免疫治疗 靶向治疗 核酸适配体 热疗 人胶质细胞瘤

【摘要】：目的：MUC1是一种重要的糖蛋白,它在多种恶性肿瘤细胞表面高表达,如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、直肠癌和前列腺癌,但在正常细胞表面表达水平较低,使它成为肿瘤靶向治疗中一种重要的靶标。目前已经报道过一些针对MUC1阳性肿瘤的靶向治疗方法,如针对MUC1蛋白的靶向给药系统以及单克隆抗体等,但通过靶向性地动员NK细胞(natural killer celis)来杀伤MUC1阳性的肿瘤细胞尚未见文献报道。NK细胞是机体重要的免疫细胞,与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,某些情况下还参与超敏反应和自身免疫调节病的发生。本课题设计了一种修饰有MUC1和CD16核酸适配体的两亲性纳米颗粒,可同时结合CD16阳性的NK细胞和MUC1阳性的肿瘤细胞,并将两种细胞拉近。此外,我们还在体外探索了该两亲性纳米颗粒能否靶向性的增强NK细胞对MUC1阳性肿瘤细胞的免疫杀伤作用。方法：CD16核酸适配体和MUC1核酸适配体通过链霉素-亲和素之间的特异性结合到反应连接到纳米颗粒表面形成两亲性纳米颗粒,该颗粒可以同时结合CD16阳性的自然杀伤细胞(NK)和MUC1阳性的肿瘤细胞,并将这两种细胞拉近,从而靶向性的增强NK对这些肿瘤细胞的免疫反应。流式细胞术用来检测两种核酸适配体与各自靶细胞的结合情况；DNA杂交实验用来检测核酸适配体与纳米粒子的连接；动态光散射实验用来检测两亲性纳米粒的尺寸及分布；共聚焦显微镜用来观察两亲性纳米颗粒的形态；竞争实验用来检测适配体修饰的两亲性纳米粒与靶细胞的结合情况；暗视野显微镜用来观察两亲性纳米粒子是否可以将两种细胞拉近；细胞活性实验用来检测两亲性纳米粒子是否可以靶向性的增强NK对MCU1阳性肿瘤细胞的免疫杀伤作用。结果：本实验构建了一种修饰有CD16和MUC1核酸适配体的两亲性纳米粒子(CD16-NP-MUC1),可同时结合NK和MUC1阳性肿瘤细胞,并拉近两种细胞的距离；流式细胞术显示CD16核酸适配体可结合外周血单个核细胞中的自然杀伤细胞,MUC1核酸适配体可结合MUC1阳性的A549肿瘤细胞,而不结合MUC1阴性的MDA-MB-231肿瘤细胞；DNA杂交实验显示CD16和MUC1核酸适配体已被组装到了纳米颗粒上；动态光散射实验显示两亲性纳米颗粒的平均尺寸为574 nm并且呈单峰分布；共聚焦显微镜显示两亲性纳米颗粒呈近圆形；竞争实验显示修饰有适配体的纳米粒子可结合靶细胞；暗视野显微镜观察到两亲性纳米粒子可以靶向性地募集NK到MUC1阳性肿瘤细胞附近；细胞活性实验显示两亲性纳米粒子可以增强NK对MUC1阳性细胞A549的免疫杀伤作用,而对MUC1阴性细胞MDA-MB-231没有影响。结论：修饰有CD16和MUC1适配体的两亲性纳米粒子可拉近NK和MUC1阳性肿瘤细胞,在体外靶向性地增强NK对MUC1阳性肿瘤细胞的免疫杀伤作用。通过募集NK来靶向性地杀伤MUC1阳性肿瘤细胞这一策略在研发新型针对MUC1的靶向免疫疗法中有应用潜能。目的：神经胶质瘤是最常见的成人原发性颅内肿瘤,其中恶性成胶质母细胞瘤是最具有侵袭力的一种,患者生存时间极短。由于恶性成胶质母细胞瘤致死率高,且对正常组织细胞有很强的侵袭力,传统治疗如手术、化疗、放疗等很难将其根除,因此迫切需要探索一种新型的针对恶性成胶质母细胞瘤的治疗方法。肿瘤的热疗是继手术、放疗、化疗、免疫疗法以外的第五种重要疗法,该疗法是利用高温环境使肿瘤细胞发生不可逆的变化导致其凋亡。传统的肿瘤热疗所使用的热敏剂缺乏肿瘤靶向性,常损伤正常组织,因此目前急需探索新型的靶向肿瘤热疗方法。核酸适配体是近几年被广泛研究的靶向分子,它能以较强的特异性和较高的亲和力同靶标分子结合,被广泛研究应用与肿瘤靶向给药系统及肿瘤的早期诊断。本课题构建了一种新型的核酸适配体修饰的铁纳米粒子(Apt-NP),并首次探索了该粒子在体外对人恶性成胶质母细胞瘤细胞的靶向热疗效应。方法：流式细胞术用来检测该核酸适配体的特异性和对靶细胞的结合能力；荧光DNA探针杂交实验检测核酸适配体是否结合到了纳米粒子表面；动态光散射粒径仪分析核酸适配体修饰的铁纳米粒的尺寸分布；铁染色法检测核酸适配体修饰的铁纳米粒结合靶细胞的能力；通过检测磁场条件下细胞释放的乳酸脱氢酶来评估体外核酸适配体修饰的铁纳米粒的靶向热疗效应。结果：流式细胞术显示本课题选用的核酸适配体可以特异性的结合人胶质瘤U251细胞；DNA荧光探针杂交实验显示该核酸适配体确实组装到了铁纳米磁珠上；动态光散射粒径仪显示该核酸适配体的平均直径为574 nm；铁染色显示该核酸适配体修饰的铁纳米粒较强结合人胶质瘤U251细胞；乳酸脱氢酶释放检测实验显示在体外交变磁场的条件下,核酸适配体修饰的铁纳米粒可以显著提升对人胶质瘤U251细胞的热疗杀伤效应(P0.05),而对照的MD-MBA-231细胞的热疗效应没有明显增强。结论：核酸适配体修饰铁纳米粒可以显著提升对人胶质瘤U251细胞的热疗杀伤作用,在肿瘤靶向热疗方面具有潜在的应用价值。
【关键词】：MUC1 CD16 纳米材料 核酸适配体 免疫治疗 靶向治疗 核酸适配体 热疗 人胶质细胞瘤
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.5
【目录】：

• 第一部分 核酸适配体修饰的铁纳米颗粒靶向性的提升NK对MUC1阳性肿瘤细胞的免疫杀伤作用6-43
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-17
• 1. MUC1阳性肿瘤的治疗手段10-11
• 2. MUC1蛋白11-12
• 3. 免疫治疗及自然杀伤细胞12
• 4. 核酸适配体12-13
• 5. 纳米技术在肿瘤治疗中的应用13-14
• 6. 选题依据以及意义14
• 7. 研究策略以及技术路线14-15
• 8. 技术路线15-17
• 第二章 材料与方法17-27
• 1. 主要材料和试剂17-20
• 1.1 人外周血来源17
• 1.2 细胞系17
• 1.3 顺磁性氧化铁纳米颗粒17
• 1.4 单链寡核苷酸和引物17-18
• 1.5 细胞培养试剂18-19
• 1.6 试剂盒19
• 1.7 化学试剂19
• 1.8 溶液的配置19-20
• 1.9 细胞培养耗材20
• 2. 实验仪器和设备20-21
• 3. 实验方法21-27
• 3.1 人外周血单个核细胞(PBMC)的分离21
• 3.2 细胞培养21
• 3.3 MUC1-NP-CD16复合物的构建21-22
• 3.3.1 核酸适配体的扩增21-22
• 3.3.2 构建两亲性MUC1-NP-CD16复合物22
• 3.4 MUC1-NP-CD16的表征检测22-23
• 3.4.1 利用激光共聚焦显微镜评估MUC1-NP-CD16复合物的形态22
• 3.4.2 利用动态光散射粒径仪评估MUC1-NP-CD16复合物的大小22-23
• 3.5 流式检测23-24
• 3.5.1 流式检测MUC1和CD16核酸适配体的亲和特性23
• 3.5.2 流式检测MUC1和CD16核酸适配体是否连接到铁纳米粒上23-24
• 3.6 相差显微镜成像分析检测24
• 3.7 竞争实验24
• 3.8 免疫杀伤实验24-26
• 3.8.1 MUC1-NP-CD16影响NK细胞对MUC1阳性肺癌细胞A549的免疫杀伤的研究24-25
• 3.8.2 MUC1-NP-CD16影响NK细胞对MUC1阴性乳腺癌细胞MD-MBA-231的免疫杀伤的研究25-26
• 3.9 统计学处理26-27
• 第三章 实验结果与分析27-38
• 1. 两亲性纳米粒的构建27-28
• 2. PCR制备核酸适配体28-29
• 3. 核酸适配体特异性的检测29-30
• 4. 核酸适配体同纳米粒的连接30-32
• 5. 两亲性纳米粒的表征32-33
• 6. 核酸适配体修饰的纳米颗粒能够结合靶细胞33-34
• 7. 两亲性纳米颗粒可以募集NK到A549细胞附近34-35
• 8. 两亲性纳米颗粒影响NK免疫杀伤作用的研究35-38
• 第四章 讨论与结论38-40
• 1. 讨论38-39
• 2. 结论39-40
• 参考文献40-43
• 第二部分 核酸适配体修饰的铁纳米粒对人胶质瘤细胞的靶向热疗效应43-71
• 摘要43-45
• Abstract45-47
• 第一章 前言47-52
• 1. 神经胶质瘤的治疗47-48
• 2. 表皮生长因子受体突变体Ⅲ型48
• 3. 肿瘤热疗48-49
• 4. 课题设计49-50
• 5. 研究策略50
• 6. 技术路线50-52
• 第二章 材料与方法52-58
• 1. 主要材料和试剂52-54
• 2. 实验仪器和设备54-55
• 3. 实验方法55-58
• 3.1 细胞培养55
• 3.2 Apt-NP的构建55-56
• 3.3 流式检测56
• 3.4 表征检测56
• 3.5 吸光度值检测56
• 3.6 Apt-NP热疗效率检测56-57
• 3.7 统计学分析57-58
• 第三章 实验结果与分析58-66
• 1. PCR制备核酸适配体58-59
• 2. 核酸适配体的结合性质分析59-60
• 3. Apt-NP的构建60-62
• 4. Apt-NP的尺寸表征62
• 5. Apt-NP特异性地结合人胶质瘤U251细胞62-64
• 6. Apt-NP对热疗效果的靶向调节作用64-66
• 第四章 讨论与结论66-68
• 1. 讨论66-67
• 2. 结论67-68
• 参考文献68-71
• 附录一 英文缩略词汇表71-73
• 附录二 个人简历73-74
• 致谢74-76

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