具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC的建立及其肿瘤干细胞和上皮-间质转化生物学特性的初步研究

发布时间：2017-10-01 20:18

本文关键词：具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC的建立及其肿瘤干细胞和上皮-间质转化生物学特性的初步研究

【摘要】：背景：肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,在男性和女性中均为肿瘤死亡的首要原因。肺腺癌是最常见的一种非小细胞肺癌,通常起始于肺偏外部的组织,可能在出现症状和被诊断以前就已存在很长时间。关于肺癌发病和转移的机制至今尚不明确,临床对此缺乏有效的治疗方法,因此,研究肺癌发病和转移的机制并探索有效的诊疗方法是亟待解决的课题。肺癌转移的研究途径分为体内和体外两种,体内途径多是通过动物体内的筛选来建立肺癌转移的实验模型,体外途径则主要是通过建立类似人工基质膜的生物膜系统来模拟转移的过程。二者均存在一定的局限性,这在很大程度上滞后了肺癌转移诊疗研究的进展。迄今常用的肺腺癌细胞系如A549、SPC-A1等多取材于临床手术切除的标本,其分期较早,对于肺癌转移的研究具有一定的局限性。肺腺癌转移的细胞模型多是通过有限稀释法分离出亚克隆细胞株,再经动物体内的筛选,建立转移力高的细胞亚株。然而在体外培养时随着生长环境的不同,细胞特性也在不断变化,也可能发生如基因突变、基因异位或缺失等变化,其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变化,这对于研究肿瘤转移的发生发展的内在机制是不利的。恶性胸腹水的出现表明癌症已有浸润或转移。以晚期肺腺癌患者的胸水或腹水为瘤源培养建立具有转移潜能的人肺腺癌细胞系,将减少因体外实验因素造成的对肺癌细胞内在生物学行为的影响,将为研究肺癌转移的机制和识别肿瘤治疗靶点提供良好的细胞模型。肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)学说为肺癌转移的治疗提供了全新的研究方向,成为了研究的热点趋势。从肿瘤干细胞理论的角度来探索肿瘤转移的生物学机制,可为进一步寻找治疗肺癌转移的靶点提供理论依据。上皮-间质转变(epithelia-mesenchymal transition, EMT)是指细胞由上皮表型向间质表型的转变,这种转变是引起肿瘤远处转移的关键步骤。因此探索所建立的具有转移潜能的人肺腺癌细胞系是否存在EMT现象,将为进一步揭示人肺腺癌转移发生的本质提供新的视角,同时也为人肺腺癌治疗的分子基础研究提供新的思路。目的：1.以人肺腺癌患者恶性腹水为瘤源,经原代培养、传代,建立具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC (Metastastic Lung Adenoarcinoma);2.研究具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC的基本生物学特性；3.初步研究具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC是否具有肿瘤干细胞和上皮=间质转化的生物学特性。方法：1.具有转移潜能的肺腺癌细胞系M-LAC (Metastastic Lung Adenoarcinoma)韵建立：离心分离法从人肺腺癌患者恶性腹水中分离获得肺腺癌细胞,优化最适合细胞生长的培养条件,采取差异贴壁法和胶原酶消化法结合去除成纤维细胞,纯化细胞系。2.具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC的生物学特性的研究：(1)光镜观察细胞形态；(2)绘制细胞生长曲线、分析群体倍增时间了解细胞生长与增殖特性；(3)检测克隆形成率了解细胞集落形成能力；(4)染色体核型分析探讨细胞遗传学特性；(5)免疫细胞化学和免疫细胞荧光鉴定M-LAC的组织起源；(6)体外侵袭模型Matrigel-Transwell小室法分析M-LAC体外侵袭能力；(7)裸小鼠皮下接种M-LAC,观察其致瘤性,通过病理及免疫组织化学染色观察有无淋巴道及血道的转移；(8)检测有无支原体的污染,判断M-LAC是否符合建立细胞系的标准。3.研究具有转移潜能的人肺腺癌细胞M-LAC的肿瘤干细胞和上皮-间质转化生物学特性：(1)流式细胞仪比较M-LAC与对照组A549的肿瘤干细胞标志分子CD133含量的差异；(2) Western Blot法比较M-LAC与对照组A549的肿瘤干细胞标志分子Oct4和ABCG2以及上皮-间质转化相关分子E-Cadherin和Vimentin含量的差异；(3)RT-PCR法比较M-LAC和对照组A549的肿瘤干细胞标志物(CD133、Oct4、ABCG2)、血管生成因子VEGF-A、炎症因子TNF-α肿瘤抑制基因p53、Rb、肿瘤促增殖基因c-myc的表达量的差异。结果：1.以人肺腺癌患者恶性腹水为瘤源,经原代培养、传代,利用差异贴壁法与胶原酶消化法结合,成功纯化培养出具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC。2.具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC在倒置显微镜下呈互不重叠的单层生长,细胞形态多样,表现为梭形、三角形或多角形；细胞生长群体倍增时间为29.07±0.278 h,细胞增殖能力强；克隆形成率为17.8%,集落形成能力高；染色体核型以非整倍体核型为主,亚四倍体占分析核型的35%,余可见单倍体、超三倍体等核型,细胞染色体不稳定。免疫细胞化学结果表明90%细胞表达Ⅱ型肺泡上皮标志蛋白SFTPC,免疫细胞荧光显示90%细胞表达上皮来源标志物Cytokeratin7,85%细胞表达上皮表型标记分子E-Cadherin,另有10%细胞表达间质表型标记分子中间丝波形蛋白Vimentin。 Matrigel-Transwell小室法结果表明M-LAC体外侵袭能力强于对照组A549；异种动物接种裸小鼠致瘤率为100%,淋巴道转移率50%,血道转移率25%；细胞系在培养过程中无支原体污染,。符合建系的标准。3.通过流式细胞仪测得人肺腺癌细胞系M-LAC与对照组A549的肿瘤干细胞标志分子CD133含量分别为8.095%和5.0%,M-LAC的CD133含量相对高于对照组A549。通过Western Blot法测得人肺腺癌细胞系M-LAC组肿瘤干细胞标记分子Oct4蛋白相对表达量为3.586±0.024,对照组A549为2.912±0.013,M-LAC的Oct4蛋白的含量高于对照组A549；同时M-LAC组肿瘤干细胞标记分子ABCG2蛋白相对表达量为3.834±0.028,对照组A549为1.561±0.016,M-LAC的 ABCG2蛋白的含量高于A549。结果提示人肺腺癌细胞系M-LAC具有转移潜能可能与肿瘤干细胞的比例高有关。4.通过Western Blot法测得人肺腺癌细胞系M-LAC组上皮表型标记分子E-Cadherin蛋白相对表达量为1.236±0.017,对照组A549为1.431±0.018,M-LAC的E-Cadherin蛋白的含量相对低于A549。同时测得M-LAC组间质表型标记分子Vimentin蛋白相对表达量为2.064±0.028,对照组A549为1.022±0.027,M-LAC的Vimentin蛋白的含量相对高于A549。结果表明上皮性标志蛋白含量降低,间质性蛋白含量增高,提示人肺腺癌细胞系M-LAC具有转移潜能可能与细胞发生了上皮-间质转化有关。5. RT-PCR法检测结果显示示人肺腺癌细胞系M-LAC在肿瘤干细胞标记分子CD133、Oct4、ABCG2的基因表达量上均高于对照组A549。同时M-LAC在肿瘤抑制基因p53、Rb、促增殖基因c-myc、炎症因子TNF-α、血管生成相关因子VEGF-A基因表达量上也相对高于对照组A549细胞。其结果可能与人肺腺癌细胞系M-LAC增殖能力高及具有转移潜能相关。结论：1.以人肺腺癌患者恶性腹水为瘤源成功建立了具有淋巴道和血道双向转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC (Metastastic Lung Adenoarcinoma),异种动物接种裸小鼠致瘤率为100%,且50%淋巴道转移,25%血道转移。2.人肺腺癌细胞系M-LAC群体倍增时间29.070±0.278 h,克隆形成率为17.8%,染色体以非整倍体核型为主,组织起源鉴定表达肺泡上皮标志SFTPC、上皮表型标记分子cytokeratin7和E-Cadherin,同时少量表达间叶表型标记分子Vimentin,体外侵袭力相对高,可异种移植致瘤,细胞培养过程中无支原体污染,符合建系标准,提示建系成功。3.人肺腺癌细胞系M-LAC的转移潜能可能与肿瘤干细胞的比例高有关,同时也可能与细胞发生了上皮-间质转化有关。4.人肺腺癌细胞系M-LAC肿瘤抑制基因p53、Rb、促增殖基因c-myc、炎症因子TNF-α和血管生成相关因子VEGF-A基因在基因表达水平上均相对高于对照组人肺腺癌细胞系A549。
【关键词】：人肺腺癌细胞系 M-LAC 转移 肿瘤干细胞 上皮-间质转化 基因表达
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

中文摘要9-13
英文摘要13-18
第一部分具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC的建立18-45
前言18-19
材料和方法19-27
1. 研究对象19-20
1.1 人肺腺癌恶性腹水19
1.2 人肺腺癌细胞系A54919-20
1.3 实验动物20
2. 主要仪器及试剂20-21
2.1 主要仪器20
2.2 主要试剂20
2.3 主要试剂的配制20-21
3. 实验方法21-27
3.1 人肺腺癌细胞系M-LAC(Metastastic-Lung Adenoarcinoma)的建立21-22
3.2 人肺腺癌细胞系M-LAC生物学特性的研究22-27
3.3 统计学分析27
结果27-39
1. 人肺腺癌细胞系M-LAC的建立27
2. 人肺腺癌细胞系M-LAC的生物学特性27-39
2.1 人肺腺癌细胞系M-LAC的细胞形态27-28
2.2 人肺腺癌细胞系M-LAC细胞生长曲线和群体倍增时间28-29
2.3 人肺腺癌细胞系M-LAC细胞的克隆形成率29-30
2.4 人肺腺癌细胞系M-LAC细胞染色体核型分析30
2.5 人肺腺癌细胞系M-LAC组织起源鉴定30-31
2.6 体外侵袭模型Matrigel-Transwell小室法分析人肺腺癌细胞系M-LAC体外侵袭能力(与A549细胞对比)31-33
2.7 人肺腺癌细胞系M-LAC异种接种致瘤性及其病理及免疫组织化学观察33-38
2.8 人肺腺癌细胞系M-LAC支原体污染的检测38-39
讨论39-42
结论42-43
参考文献43-45
第二部分具有转移潜能的人肺腺癌细胞系M-LAC的肿瘤干细胞和上皮-间质转化生物学特性的初步研究45-67
前言45-46
材料和方法46-53
1. 研究对象46
1.1 人肺腺癌细胞系M-LAC46
1.2 人肺腺癌细胞系A54946
2. 主要仪器及试剂46-48
2.1 主要仪器46-47
2.2 主要试剂47
2.3 主要试剂的配制47-48
3. 实验方法48-53
3.1 人肺腺癌细胞系M-LAC肿瘤干细胞和EMT生物学特性的初步研究48-49
3.2 人肺腺癌细胞系M-LAC的EMT生物学特性的初步研究,通过Western Blot法比较人肺腺癌细胞系M-LAC与对照A549的上皮-间质转化相关分子E-Cadherin和Vimentin含量的差异49-50
3.3 RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和对照A549的肿瘤干细胞标志物(CD133、Oct4、ABCG2)、血管生成因子VEGF-A、炎症因子TNF-α、肿瘤抑制基因p53、Rb、肿瘤促增殖基因c-myc的表达量的差异50-53
3.4 统计学分析53
结果53-58
1. 人肺腺癌细胞M-LAC的肿瘤干细胞和上皮-间质转化生物学特性的研究53-56
1.1 人肺腺癌细胞系M-LAC与A549的肿瘤干细胞标志分子CD133、Oct4和ABCG2的表达53-55
1.2 人肺腺癌细胞系M-LAC与A549上皮-间质转化相关分子E-Cadherin和Vimentin的表达55-56
2. RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和A549的肿瘤干细胞标志物(CD133、Oct4、ABCG2)、血管生成因子VEGF-A、炎症因子TNF-α、肿瘤抑制基因p53、Rb、肿瘤促增殖基因c-myc的基因水平的表达差异56-58
2.1 RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和A549的肿瘤干细胞标志物(CD133、Oct4、ABCG2)的基因水平的表达差异56-57
2.2 RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和A549的血管生成因子VEGF-A基因水平的表达差异57
2.3 RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和A549的炎症因子TNF-α基因水平的表达差异57-58
2.4 RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和A549的肿瘤抑制基因p53、Rb基因水平的表达差异58
2.5 RT-PCR法比较人肺腺癌细胞系M-LAC和A549的肿瘤促增殖基因c-myc基因水平的表达差异58
讨论58-63
结论63-64
参考文献64-67
综述67-79
1 肿瘤干细胞的存在与肺癌干细胞的起源67-68
2 肺癌干细胞与肺癌转移的相关性68-72
3 肺癌干细胞的靶向治疗72-73
4 展望73-74
参考文献74-79
致谢79