GSTA1在肺癌细胞中的表达及其功能研究

发布时间：2017-10-02 13:07

  本文关键词：GSTA1在肺癌细胞中的表达及其功能研究

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【摘要】：目前,肺癌是全世界发病率和致死率均为最高的恶性肿瘤之一,也为我国第一大癌症,其发病率和死亡率的增长最为迅速。但是,由于其起病隐匿,尚无有效的可用于肺癌早期诊断手段和筛查的肿瘤标志物,导致了其预后和3年、5年生存率远不尽人意。要降低肺癌病人的死亡率,除了在病因预防上降低发病率外,发现特异性的肺癌肿瘤标志物,提高早期诊断水平,显得尤为重要。迄今为止,肺癌的诊断和筛查还是依赖于分子影像诊断(包括X线、CT、MRI和PET-CT),血清酶学、生化检测(包括血清中的肿瘤标志物、生化酶学和免疫学指标等),而诊断恶性肿瘤的金标准仍然是组织切片、免疫组织化学等分子病理学方法,分子影像学在亚临床期(肿瘤较小或者缺乏临床症状时)诊断上有很大的局限性,以血清肿瘤标志物和组织分子标志物为观察指标,比影像学能更早检测和发现肿瘤。因此,在肺癌早期诊断技术的研究中,筛选及确认肺癌特异性的肿瘤标志物一直是研究的重点和难点。我们课题组前期利用噬菌体展示肽库技术发现了数十个肺癌细胞特异性结合多肽,并以此为基础,筛选肺癌c DNA文库,最后发现了肺癌相关肿瘤抗原—GSTA1,关于GSTA1在肺癌中的病理生理意义,国内外文献均鲜见报道,因此,本课题系统研究了GSTA1对肺癌增殖和凋亡的影响,并阐明其机制。第一章采用激光共聚焦扫描显微镜初步验证GSTA1蛋白在肺癌细胞A549、SPCA1和MRC-5等细胞株中的表达水平,结果显示,GSTA1蛋白定位于细胞膜,而且其在癌细胞中的表达量高于肺正常细胞MRC-5。采用Western blotting和Real-time PCR进一步验证GSTA1的基因和蛋白质表达水平,结果显示,各种不同的癌细胞(肺癌A549、H460、SPCA1、LTEP-A2、肝癌Hep G2)的m RNA表达量和蛋白表达量都明显高于MRC-5细胞,特别是肺腺癌细胞A549在所检测的癌细胞中,表达量是最高的,因此,选取A549细胞作为下一步研究GSTA1功能的主要细胞株。第二章体外RNAi干扰GSTA1在肺癌细胞A549的表达,利用Western blotting和Real-time PCR筛选干扰效果最优的si RNA,构建干扰GSTA1表达的慢病毒表达载体(Si-GSTA1组)和包装GSTA1质粒的慢病毒过表达载体(GSTA1组),转染A549细胞,利用MTT、Hoechest33258和流式细胞仪观察GSTA1对肺癌细胞生长的影响。结果显示,GSTA1高表达促进了肺癌细胞A549的增殖,反之,如果沉默GSTA1的表达抑制了A549细胞的增殖,促进了细胞的凋亡。第三章研究GSTA1表达对A549细胞株裸鼠移植瘤的影响,分别将已构建好的Si-GSTA1慢病毒表达载体和GSTA1过表达载体,转染至人肺癌A549细胞株,随后将该细胞接种于裸鼠左腋皮下,建立荷人肺癌裸鼠模型,在3周内每周测量一次肿瘤组织体积及重量,绘制成肿瘤生长曲线。分别采用Western blotting和Real-time PCR检测移植瘤组织中GSTA1蛋白质和m RNA表达水平。结果显示,GSTA1过表达组的成瘤能力和生长速度均明显高于对照组,肿瘤体积和重量均高于其对照组(p0.05),相反,Si-GSTA1组成瘤能力和生长能力、肿瘤体积和重量均低于其对照组(p0.05);Western blotting和Real-time PCR结果显示,GSTA1组肿瘤组织GSTA1蛋白表达水平和m RNA表达水平均明显高于对照组(p0.05),Si-GSTA1组的肿瘤组织蛋白表达水平和m RNA表达水平均明显低于其对照组(p0.05)。这表明,下调GSTA1的表达可以抑制肺癌细胞的体内增殖能力。我们从体外、体内分别探索了GSTA1对肺癌细胞增殖和凋亡的影响,结果发现,GSTA1过表达可以促进肺癌细胞的生长,提示在组织中检测GSTA1表达量可以预测肺癌组织的恶性程度。第四章采用MTT方法检测芹菜素对肺癌细胞增殖的影响,Hoechst33258检测芹菜素对肺癌细胞核形态学的变化,流式细胞术检测芹菜素对肺癌细胞凋亡率的影响,利用Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况。芹菜素作用不同肺癌细胞48 h后,采用Western blotting和Real-time PCR检测对GSTA1蛋白表达和m RNA表达的影响,以研究GSTA1在芹菜素介导的细胞增殖和凋亡中的作用。结果显示,芹菜素呈浓度和时间的依赖性地抑制肺癌细胞的增殖,促进其凋亡。Western blotting和Real-time PCR检测结果显示,芹菜素能下调不同肺癌细胞GSTA1蛋白质和基因表达水平(p0.05),这表明芹菜素可能通过抑制GSTA1的表达,促进细胞凋亡。综上结果表明,GSTA1高表达可能促进人肺癌的发生与发展,不仅可以作为有辅助诊断价值肺癌新的肿瘤标志物,同时,GSTA1也可作为人肺癌治疗的一个潜在药物靶点。芹菜素来源于食物提取物,具有低毒、来源广、价廉物美的优点,可以通过抑制GSTA1的表达促进细胞凋亡,有望成为天然化合物类的抗肿瘤新药。
【关键词】：肺癌 肿瘤标志物 GSTA1 芹菜素
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 英文缩略语11-12
• 引言12-16
• 第一章 GSTA1在肺癌细胞中的定位及表达水平检测16-31
• 1 材料17-19
• 2 方法19-26
• 3 结果26-29
• 4 讨论29-31
• 第二章 体外研究GSTA1表达水平对肺癌细胞生长的影响31-47
• 1 材料31-32
• 2 方法32-36
• 3 实验结果36-43
• 4 讨论43-47
• 第三章 GSTA1对A549细胞株裸鼠移植瘤影响的初步研究47-54
• 1 材料47
• 2 实验方法47-48
• 3 实验结果48-51
• 4 讨论51-54
• 第四章 芹菜素处理对A549细胞GSTA1表达的影响54-68
• 1 材料54-55
• 2 实验方法55-56
• 3 实验结果56-66
• 4 讨论66-68
• 参考文献68-78
• 结论与创新性78-79
• 攻读学位期间发表的主要论文79-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 胡太平;曹建国;;芹菜素诱导人胃癌细胞凋亡作用及机制研究[J];国际病理科学与临床杂志;2007年01期

2 吴华涛;马涛;孟勇;;芹菜素对肿瘤抑制作用研究进展[J];中国现代医生;2009年06期

3 董严明;黄恺;杨兴无;杨春明;;P-糖蛋白、谷胱甘肽S转移酶和DNA拓扑异构酶Ⅱ在胆道恶性肿瘤中的表达与临床意义[J];中华普通外科学文献(电子版);2010年01期

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本文编号：959745