肝螺杆菌对肝癌细胞侵袭能力的影响及分子机制的初步研究

发布时间：2017-10-03 04:19

  本文关键词：肝螺杆菌对肝癌细胞侵袭能力的影响及分子机制的初步研究

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【摘要】：背景及目的原发性肝癌(以下简称肝癌)是由肝细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤,人类最常见的恶性肿瘤之一,而我国是肝癌的高发国,其中45%发生在我国,是我国一种常见的恶性肿瘤,在消化系统恶性肿瘤中排第三位,仅次于胃癌和食管癌。我国是世界上肝癌发生率和死亡率最高的国家,严重威胁着广大患者的健康。流行病学调查研究显示,随着人们生活环境的不断变化,在全世界范围内,肝癌发病率呈逐年上升趋势,目前全世界每年新增50万～100万病例,本病多发于中年男性,男女之比为2-5：1。肝癌的发病与治疗一直是当今医学界研究的热点,随着大量的临床实验及基础试验的深入研究,肝癌在诊断及治疗方面取的重大的进展,但相当多的肝癌发现时已是晚期,目前其临床治疗效果还相当有限。全世界肝癌患者5年生存率不到15%,死亡率为20.73/10万,全球平均每年约有25万人死于肝癌。即使是接受根治手术的病人术后5年内,复发率仍有30%至40%。目前,肝癌的治疗以外科手术为主,治疗肝癌最直接、最有效的手段仍然是肝脏肿瘤切除和肝移植术,辅以放疗、化疗以及其他辅助治疗的综合治疗手段虽然不断取得进展,但总体治疗效果仍不理想,复发与转移是影响肝癌预后的最主要原因。积极寻找肝癌侵袭转移的相关因素,阐明肿瘤转移机制仍是肝脏肿瘤防治研究的重点和难点。肿瘤的转移与其癌细胞的侵袭能力密切相关,我们可通过抑制癌细胞的侵袭来抑制肿瘤的转移。相反,如果人体长期暴露于一种促进细胞侵袭能力的环境中,发生肿瘤转移的可能性就会更高。目前普遍认为肝癌是多因素作用,多基因参与,多阶段发展的疾病,然而其发生和发展的确切机制仍未阐明。我国科研工作者对肝癌进行了长期研究发现,在我国肝癌高发区存在着数十种与肝癌发生有关的因素,其中最主要的原因是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染,肝硬化、黄曲霉素、饮水污染、遗传因素也与肝癌的发病密切相关,此外,某些其他物质如亚硝胺类、偶氮芥类、酒精、微量元素及寄生虫感染均是可疑的致肝癌物质。大量流行病学调查及基础实验证据表明,慢性感染与某些严重疾病的发生发展密切相关,包括癌症。9种传染性病原体已被证实为人类致癌物,每年全世界新增癌症病例中17%由感染所致,尤其是的发展中国家,可以达到26%,而在发达国家所占比例相对较少,为7.2%左右。炎症是肿瘤发生发展过程中的重要组成部份。许多癌症产生于慢性感染和炎症部位。慢性炎症所形成的肿瘤微环境为肿瘤的发生和生长提供了条件,是肿瘤侵袭转移不可缺少的参与者。鼻咽癌、胃癌、肝癌、宫颈癌等均是与感染相关且发病率较高的恶性肿瘤,尤其胃癌及肝癌居我国消化系统恶性肿瘤的前3位,因此重视感染因素在癌症发生发展过程中的作用,对于开发恶性肿瘤新的诊疗措施具有重要意义。在这些与肿瘤相关的感染因素中,最主要的是病毒感染,寄生虫和细菌也占一定比例。自1982年Warren等成功分离幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)以来,Hp感染已被国内外很多学者所研究,Hp被认为是世界上感染率最高的细菌之一,其作为慢性胃炎及消化性溃疡主要病因已被许多研究肯定及确认,Hp感染与胃癌的发生也密切相关,并于1994年被列为第1类致癌因子,人类首次将细菌感染与癌症的发生联系在一起。此后,随着对螺杆菌属研究的深入,越来越多的螺杆菌属细菌被鉴定和分离出,迄今已发现20多种。根据定居部位不同,螺杆菌分为胃螺杆菌和肠肝螺杆菌。肝螺杆菌作为肠肝螺杆菌中的一员,属于与肝脏疾病有明确关系的五种肝螺杆菌(幼禽螺杆菌、肝螺杆菌、胆汁螺杆菌、胆囊螺杆菌、犬螺杆菌)之一。1992年,美国国家癌症研究所的Frederick癌症研究发展中心,发现在一项长期的毒理学研究中,作为对照组并无菌饲养的A/JCr小鼠发生原因不明的肝炎和肝脏肿瘤。排除化学及其他致癌因素后,在小鼠肝脏组织中检出一种螺旋状细菌,后经电镜扫描、生化性状鉴定及基因测序证实是一种与Hp有关的新品种螺杆菌,因其与动物肝脏疾病的发生发展密切相关,1994年正式命名为肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus,H.hepaticus,Hh)。多项研究表明,Hh可长期定植于啮齿动物的肝脏,引起慢性肝炎、肝癌等病变。Hh主要定植于下消化道,包括盲肠、结肠以及肝胆管系统,目前没在胃内找到。该菌的自然宿主是鼠类,但在人类肝脏组织中也有检出的报道。国内外许多学者利用PCR、DNA序列分析、免疫组化证实了人肝癌组织中确实存在螺杆菌感染,这充分说明螺杆菌能够在人类肝组织中生存。Hh因其诱导引起的肝脏损害的病理特征与人类慢性肝病在许多方面相似,使Hh感染相关疾病的研究成为研究的热点。原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚,目前认为其发病是多因素、多步骤的复杂过程,且受环境和遗传双重因素影响。自Hp发现以来,许多新螺杆菌属成员陆续从动物及禽类等体内分离到。其中有的对人或动物有明确的致病性,有的致病性尚不明确或有潜在的致病性。众所周知,Hp感染与胃癌的发生展密切相关,后来也在猫类动物中分离出了Hp,由此促使我们思考肝癌的发生发展是否也与螺杆菌感染有关。大量研究表明人们多次通过动物实验证实Hh感染能导致某些品系小鼠肝癌的发生,Hh感染是否也可能在人肝癌的发生中起一定作用?Hh可能作为原发性肝癌的一个独立致病因素或者辅助因素,但有待更多有力的实验证据支持。近年来关注Hh致病机制的学者也在增多,但研究实验大多停留在动物和组织水平,关于Hh直接作用于细胞的报道还是寥寥无几,因此,在离体条件下,研究Hh能否作用肝癌细胞,这将有助于进一步认识Hh感染与肝癌发生发展机制的关系。新近研究发现,Toll样受体(Toll like receptor,TL R)能结合机体自身产生的一些内源性分子(即内源性配体),由于肿瘤在发生发展过程中可以产生一些能被TLRs识别的内源性配体,所以TLRs在肿瘤免疫监视中可能发挥了一定作用。而TLR4作为TLRs家族中的一员,被证实在肝癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌及肺癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达,其基因及蛋白表达水平与肿瘤的恶性程度明显相关。TLR4的功能性表达可能在癌症的发生发展过程中起着关键性的作用。很多研究表明TLR4能够促进肿瘤发生发展,TLR4的mRNA和蛋白表达水平在肝癌组织及细胞中都有增高,且TLR4的表达水平与肝癌的恶性程度呈正相关。研究认为,螺杆菌可通过直接激活TLR4而触发炎症反应,而炎症反应与肿瘤的发生发展密切相关。但是,Hh是否可促进肝癌细胞的侵袭能力还不甚清楚,其相关的机制如何还有待我们进一步探究。本研究旨在阐述Hh对肿瘤细胞本身的直接作用,研究Hh活菌对肝癌细胞侵袭能力的影响及其可能机制。因此,本课题以Hh为研究因素,以人肝癌细胞株HEPG2和HCCLM3作为研究对象,采用Transwell侵袭实验、Western-blot、RealtimePCR及siRNA干扰方法分析Hh活菌对肝癌细胞侵袭能力的影响以及其相关因子基因及蛋白水平表达差异,探讨其可能分子机制。研究方法(1)Hh对人肝癌细胞侵袭能力的影响：①分别以不同浓度的Hh活菌作用于肝癌细胞HEPG2和HCCLM3,分为以下两组,实验组为不同浓度Hh活菌(1×109CFU/ml、1×108CFU/ml、1×107CFU/ml、1x106CFU/ml)作用组,每组分别观察12h、24h、48h、72h；另以仅加入无Hh空白液体培养基为对照组。②通过Transwell实验,检测各组细胞不同时间点侵袭细胞数量,以此观察浓度不同、时间不同情况下Hh对肝癌细胞的侵袭能力的影响。并依此为根据,确定后续实验Hh的最佳刺激浓度及刺激时间。(2)Hh诱导人肝癌细胞产生IL-8、TGF-β1、 MMP-2和MMP-9的研究：①以第一部分确定的Hh活菌最佳刺激浓度及最佳刺激时间,Hh与肝癌细胞共孵育为实验组,无Hh空白液体培养基为对照组。②利用ELISA方法,检测各组细胞所分泌的IL-8和TGF-β1的浓度变化。③采用Western Blot方法,检测各组细胞内MMP-2和MMP-9蛋白的表达水平,④通过realtime PCR实验方法检测各组细胞IL-8、TGF-β1、MMP-2和MMP-9 mRNA的表达。(3)Hh通过影响TLR4/MyD88信号通路增强人肝癌细胞侵袭能力：①用Western Blot检测各组细胞中TLR4、MyD88、TRIF蛋白的表达；②利用real time PCR在mRNA水平对各组细胞TLR4、MyD88、TRIF的表达进行验证；③建立siRNA干扰系统,下调HEPG2和HCCLM3细胞中TLR4和MyD88基因的表达,使用Western Blot检测TLR4、MyD88表达水平,验证siRNA干扰的效果。分别设置TLR4 siRNA、MyD88 siRNA干扰组、阴性对照组(转染无关序列)和空白对照组(空白转染),用Hh作用为各组细胞,通过Transwell实验检测各组细胞侵袭能力是否有变化。研究结果(1)Hh对人肝癌细胞侵袭能力的影响：①实验组细胞的侵袭能力明显高于对照组(P0.05),并且在一定范围内随着Hh刺激浓度的增加,肝癌细胞侵袭能力增加,同时间段内,刺激浓度为1×108CFU/ml时侵袭能力到达峰值。②在各浓度组中,在一定范围内,随着Hh活菌作用时间的延长,Hh对肝癌细胞侵袭能力的作用增加,同浓度时,刺激时间为48h侵袭能力达到峰值。(2)Hh诱导人肝癌细胞产生IL-8、TGF-β1、 MMP-2和MMP-9的研究：经Hh活菌刺激后,实验组分泌IL-8和TGF-β1的水平明显高于对照组(P0.05),HEPG2和HCCLM3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平也显著提高,mRNA水平也证明了相似的结果(P0.05)。(3)Hh通过影响TLR4/MyD88信号通路增强人肝癌细胞侵袭能力：①实验组中,HEPG2和HCCLM3细胞中TLR4、MyD88蛋白水平明显高于对照组(P0.05),TRIF的表达水平与对照组没明显差异(P0.05)。mRNA水平也证明了相似的结果。②siRNA干扰系统可以成功实现对HEPG2和HCCLM3细胞中TLR4或MyD88分子表达的干扰。Western Blot实验结果显示,在人肝癌细胞转染siRNA后几乎不表达TLR4或MyD88。Hh活菌作用于各组细胞后,Transwell实验显示,与正常对照组相比,Hh不能增加实验组细胞的侵袭能力,此时这些肝癌细胞的侵袭能力下降。研究结论(1)Hh活菌能以时间和浓度依赖的方式增加肝癌细胞HEPG2和HCCLM3细胞的侵袭能力。(2)Hh诱导肝癌细胞分泌IL-8、TGF-β1及表达MMP-2和MMP-9,这些升高的细胞因子以及蛋白均可以帮助肝癌细胞消化人工基质膜,从而促进肝癌细胞的侵袭能力。这可能是Hh增强肝癌细胞的侵袭能力的机制之一(3)Hh活菌可以上调肝癌细胞株HEPG2和HCCLM3中TLR4及其下游分子MyD88蛋白及mRNA的表达水平,但不影响TRIF的表达,说明Hh活菌可能特异激活肝癌细胞内TLR4/MyD88信号通路。(4)Hh活菌不能增加不表达TLR4或MyD88的肝癌细胞侵袭能力,此时肝癌细胞的侵袭能力下降明显。这表明,Hh活菌增强人肝癌细胞的侵袭能力是通过TLR4/MyD88信号通路介导的,TLR4/MyD88对肝癌细胞的侵袭能力也十分关键。
【关键词】：肝螺杆菌 肝癌 侵袭 Toll受体4
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 前言18-23
• 第二章 肝螺杆菌对人肝癌细胞侵袭能力的影响23-45
• 2.1 材料与方法23-37
• 2.2 结果37-40
• 2.3 讨论40-44
• 2.4 结论44-45
• 第三章 肝螺杆菌通过影响TLR4/MyD88信号通路增强人肝癌细胞侵袭能力45-60
• 3.1 材料与方法45-54
• 3.2 结果54-57
• 3.3 讨论57-59
• 3.4 结论59-60
• 参考文献60-64
• 附录64-65
• 攻读学位期间成果65-66
• 致谢66-67

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