敲低XIST抑制非小细胞肺癌增殖与转移的研究

发布时间：2017-10-03 05:50

  本文关键词：敲低XIST抑制非小细胞肺癌增殖与转移的研究

  更多相关文章： 非小细胞肺癌 长链非编码RNA XIST 增殖 凋亡 转移

【摘要】：背景与目的:在当前环境下,肺癌已经成为世界上最常见且发病率极高的一类恶性肿瘤,据统计肺癌的死亡率高居各类癌症首位,其中NSCLC在所有的肺癌患者中又占据了80-85%。NSCLC患者治疗总体的5年生存率依然很低,仅仅约16%。新的诊断肺癌的分子生物学标志物的发现,对于NSCLC的早期诊断及早期治疗尤为重要。在肺癌的发生与发展的过程中一直伴随非编码RNA(non-coding RNA)的表达变化,部分nc RNA已经成为NSCLC研究的靶标。nc RNA又可以细分为2种:小的非编码RNAs(small nc RNAs)与长链非编码RNA(long nc RNAs)。Lnc RNA表达具有时间、空间以及组织等的特异性,它的异常表达与许多人类疾病包括癌症有关。lnc RNA可通过染色质重塑、DNA或组蛋白甲基化而改变基因的表达,还具有吸附mi RNA的海绵等功能。XIST是哺乳动物体内X染色体失活的主要调节基因,XIST在人类细胞分化、增殖和基因组功能的维护方面发挥重要作用。然而,XIST基因不正常表达可能与癌症的发生有关。尽管有关lnc RNA XIST的研究已有较多报道,但是XIST与肺癌是否存在某种调节关系,NSCLC的发展与XIST基因表达的调控关系仍未见报道。本研究旨在探讨肺癌中XIST基因的表达改变,以及由XIST基因表达变化对NSCLC发展与转移的调节作用。材料与方法:(1)通过设计XIST基因引物和real-time PCR技术在多种肺癌细胞中检测XIST的表达情况;(2)应用si RNA干扰实验在A549、NCI-H1299(后面简称H1299)细胞将XIST敲低,划痕实验探究XIST敲低后细胞的迁移能力改变,transwell实验用于探究XIST被敲低后肺癌细胞的侵袭能力改变,使用荧光实验再次对XIST敲低后的癌细胞侵袭能力进行验证;(3)构建XIST被敲低的慢病毒,慢病毒感染癌细胞A549与H1299,并筛选得到稳定敲低XIST的肺癌细胞,流式细胞术与CCK-8实验检测XIST被敲低后细胞的增殖能力及凋亡情况变化,平板克隆实验也可用于探究XIST基因对细胞增殖的影响;(4)异种移植瘤模型实验,在体内验证XIST被敲低后,肿瘤的增殖能力是否与细胞水平一致。(5)western blot实验探究XIST调节肺癌生长与转移相关的信号通路或者蛋白,确定XIST的作用靶点;(6)通过生物信息学分析软件,发现XIST基因与mi R-449a存在可能相互作用的靶点,设计XIST基因定点突变,采用real-time PCR技术和luciferase荧光实验对信息学分析结果进行验证。结果:(1)Real-time PCR实验结果发现,与正常的人支气管细胞相比,所选取肺癌细胞系中XIST基因均出现了不同程度的表达升高,在转移能力较强的H1299细胞中XIST的表达高于转移能力弱的H460细胞;(2)采用si RNA能够成功敲低XIST基因并且在A549及H1299细胞内进行验证。在A549及H1299细胞内XIST基因被敲低后,划痕实验发现两个细胞系的划痕愈合能力出现不同程度的降低。transwell实验分别对细胞的转移能力及侵袭能力进行研究,发现在XIST被敲低后细胞的转移能力出现下降,同时细胞的侵袭能力也降低。通过荧光实验对细胞的侵袭能力验证发现,XIST敲低后细胞的侵袭能力降低;(3)采用慢病毒感染,筛选出XIST基因稳定低表达的A549与H1299细胞株,流式细胞检测结果表明当XIST被敲低后,A549与H1299细胞的凋亡率增加,CCK-8实验结果表明XIST敲低后的细胞增殖能力显著降低,平板克隆实验结果也显示阴性对照组细胞的增殖数远多于实验组。细胞非贴壁生长能力检测结果显示XIST敲低后H1299与A549细胞球的数量低于阴性对照组。(4)裸鼠皮下成瘤实验,采用稳定低表达XIST的A549细胞在小鼠体内成瘤的能力低于阴性对照组。(5)western blot结果显示当XIST被敲低后,与凋亡及转移相关蛋白均出现不同程度的表达变化。(6)Luciferase实验表明在XIST定点突变后,mi R-449a过表达时荧光增强,当野生型XIST基因存在时过表达mi R-449a荧光减弱,当野生型XIST基因与mi R-NC同时存在时,荧光增强。结论:(1)XIST基因在NSCLC细胞系表达增加,促进肺癌细胞增殖,抑制肺癌细胞的凋亡。(2)敲低XIST时肺癌细胞的转移与侵袭被抑制,表明XIST可能具有促进肺癌转移与侵袭的能力。(3)XIST基因可能通过下调mi R-449a基因,从而使Bcl-2蛋白表达增加抑制肺癌细胞凋亡。
【关键词】：非小细胞肺癌 长链非编码RNA XIST 增殖 凋亡 转移
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-15
• 研究现状、成果11-12
• 研究目的、方法12-15
• 一、XIST被敲低可抑制非小细胞肺癌的发展15-46
• 1.1 对象和方法15-29
• 1.1.1 实验材料15-18
• 1.1.2 细胞培养18-19
• 1.1.3 RNA提取19-22
• 1.1.4 细胞表型实验22-29
• 1.2 结果29-41
• 1.2.1 长链非编码RNA XIST基因在肺癌细胞中表达增加29-31
• 1.2.2 当XIST基因表达降低后，，NSCLC细胞的增殖能力降低31-32
• 1.2.3 敲低XIST后NSCLC细胞凋亡率增加32
• 1.2.4 平板克隆实验证实敲低XIST后NSCLC细胞增殖能力降低32-34
• 1.2.5 划痕实验与transwell转移实验表明干扰XIST基因后细胞的转移能力降低34-36
• 1.2.6 当XIST基因被干扰后NSCLC细胞的侵袭能力明显降低36-37
• 1.2.7 动物实验表明当XIST基因被干扰后NSCLC的生长被抑制37-41
• 1.3 讨论41-44
• 1.4 小结44-46
• 二、XIST通过抑制miR-449a基因而上调Bcl-2 蛋白表达46-58
• 2.1 对象和方法46-52
• 2.1.1 实验材料46-48
• 2.1.2 细胞培养48-49
• 2.1.3 Luciferase及western blot实验49-52
• 2.2 结果52-56
• 2.2.1 长链非编码RNA XIST基因与miR-449a相互抑制52-53
• 2.2.2 Luciferase结果表明XIST基因与miR-449a可能作用关系53-54
• 2.2.3 Western blot结果研究与XIST功能相关蛋白的变化54-56
• 2.3 讨论56-58
• 结论58-59
• 参考文献59-63
• 发表论文和参加科研情况说明63-64
• 综述 肿瘤细胞代谢与肿瘤转移相互关系的研究进展64-76
• 综述参考文献71-76
• 致谢76-77
• 个人简历77

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本文编号：963511