组织特异性溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤干细胞的作用

发布时间：2017-10-03 09:39

  本文关键词：组织特异性溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤干细胞的作用

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【摘要】：目的:每年新发膀胱肿瘤中,大约70%的是非肌层浸润性膀胱癌,经尿道膀胱肿瘤电切除术手术和膀胱内化疗药物灌注是目前最主要的治疗方式,但经过治疗后,5年内仍将近一半的膀胱肿瘤发生复发或进展成肌层浸润性膀胱癌。学者们认为这可能与膀胱肿瘤干细胞有关。膀胱肿瘤干细胞是存在于膀胱肿瘤中的少数具有自我更新和增殖分化潜能的细胞,膀胱肿瘤的化疗药物抵抗、复发和进展与膀胱肿瘤干细胞的存在密切相关。该次研究应用ALDEFLUOR kit分选试剂盒通过流式细胞仪分选膀胱肿瘤干细胞,并对其进行肿瘤干细胞鉴定;测定膀胱肿瘤干细胞表面CAR和CD46的表达情况;用本实验室前期已构建完成的膀胱组织特异性溶瘤腺病毒感染膀胱肿瘤干细胞,观察Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR(APU-E1A-AR)膀胱肿瘤特异性溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤干细胞的杀伤效果。方法:常规培养膀胱肿瘤细胞株T24和EJ。应用ALDEFLUOR kit分选试剂盒通过流式细胞仪分选膀胱肿瘤干细胞;首先,用无血清平板克隆形成实验观察膀胱肿瘤干细胞的克隆形成能力,用40uM顺铂干预膀胱肿瘤细胞,测定存活细胞内ALDH的表达情况,继续培养分选得到的膀胱肿瘤干细胞一段时间后,测定细胞内ALDH的表达情况,观察膀胱肿瘤干细胞是否有部分发生分化。综合膀胱肿瘤干细胞的克隆形成能力、化疗药物抵抗及分化能力对分选所得细胞进行鉴定。其次,提取膀胱肿瘤细胞及膀胱肿瘤干细胞RNA,用RT-PCR法测定膀胱肿瘤干细胞中CAR基因和CD46基因的表达情况,比较两种细胞内CAR与CD46的表达是否有差异;用细胞免疫化学方法检测膀胱肿瘤干细胞表面CAR和CD46的情况,同时将其表达量与未分选膀胱肿瘤细胞进行对比;用MTT法检测膀胱组织特异性溶瘤腺病毒杀伤膀胱肿瘤干细胞的最佳病毒滴度和干预时间,用分选得到的最佳干预方案对膀胱肿瘤干细胞进行干预,在光学显微镜下观察膀胱组织特异性溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤干细胞的干预效果。结果:经过分选发现,约有15%的膀胱肿瘤细胞内是膀胱肿瘤干细胞,与未经分选的膀胱肿瘤相比,膀胱肿瘤干细胞的克隆形成能力强,可继续分化出ALDH(—)细胞,并具有化疗药物抵抗能力,以上一系列表现均符合肿瘤干细胞的特性。RT—PCR结果发现,膀胱肿瘤干细胞表面CAR基因的表达较未分选膀胱肿瘤细胞低,两种肿瘤细胞内的CD46基因表达无明显差异;细胞组织化学实验结果发现,膀胱肿瘤干细胞内CAR的表达较未分选肿瘤细胞低,两者的CD46表达都比较高。通过MTT法发现,病毒MOI值为80,干预48h后,超过一半的膀胱肿瘤干细胞发生裂解死亡,说明膀胱组织特异性溶瘤腺病毒Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR对膀胱肿瘤干细胞具有一定杀伤作用。结论:用ALDH作为分子标记物分选得到的ALDH(+)膀胱肿瘤细胞具有化疗药物抵抗、自我更新及继续分化等能力,符合肿瘤干细胞的特性,因此ALDH可以作为分选膀胱肿瘤干细胞的分子标志物。同时,用MOI为80的膀胱组织特异性溶瘤腺病毒对膀胱肿瘤干细胞作用48h后出现一定干预效果。
【关键词】：膀胱肿瘤干细胞 组织特异性溶瘤腺病毒 柯萨奇病毒受体 ALDH
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.14
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 前言9-17
• 1.1 膀胱肿瘤干细胞研究及治疗进展9-15
• 1.2 基因治疗15
• 1.3 溶瘤腺病毒可靶向治疗膀胱肿瘤干细胞15-16
• 1.4 本实验研究目的及技术路线16-17
• 第二章 材料与方法17-23
• 2.1 主要实验材料与试剂17
• 2.2 主要实验仪器17-18
• 2.3 细胞培养与处理18
• 2.4 干细胞分选18-19
• 2.5 肿瘤细胞平板克隆形成实验19-20
• 2.6 大剂量顺铂（CIS）诱导肿瘤干细胞实验20
• 2.7 MTT法检测细胞存活率20-21
• 2.8 免疫细胞化学21-22
• 2.9 实时荧光定量PCR（RT—PCR）22-23
• 第三章 结果23-30
• 3.1 膀胱肿瘤干细胞的分选和鉴定23-24
• 3.2 膀胱肿瘤干细胞分化鉴定24-25
• 3.3 膀胱肿瘤干细胞平板克隆形成实验25
• 3.4 大剂量顺铂干预后存活膀胱肿瘤细胞ALDH的表达情况25-26
• 3.5 膀胱肿瘤干细胞CAR和CD46的表达情况26-27
• 3.6 Ad-PSCAE-UPⅡ-E1A-AR溶瘤腺病毒干预膀胱肿瘤干细胞27-30
• 第四章 讨论30-35
• 第五章 结论35-36
• 第六章 参考文献36-40
• 第七章 在学期间的研究成果40-41
• 第八章 致谢41-42
• 第九章 中英文缩写对照42

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