热休克蛋白90抑制剂BIIB021对慢性粒细胞白血病作用及其机制的研究

发布时间：2017-10-04 08:39

  本文关键词：热休克蛋白90抑制剂BIIB021对慢性粒细胞白血病作用及其机制的研究

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【摘要】：第一部分：BIIB021对CML细胞株抑制生长、诱导凋亡的作用及其机制目的：研究BIIB021对CML细胞株抑制生长和诱导凋亡的作用,并探索BIIB021诱导CML凋亡的分子机制。方法：MTT法检测BIIB021对CML细胞株生长抑制的作用,AV/PI流式细胞术检测细胞凋亡,Western-blot法检测Caspase-3、Caspase-9和PARP蛋白的表达变化。Western-blot法检测线粒体凋亡相关蛋白表达变化。Real-Time PCR检测BIIB021作用后BCR-ABL mRNA水平,Western-blot法检测BCR-ABL蛋白水平及其下游的Jak/Stat通路、Akt/mTOR通路、Erk通路以及β-Catenin/c-Myc通路的蛋白表达量变化。激光共聚焦检测BIIB021作用后β-Catenin表达量的变化。结果:(1)BIIB021能显著抑制CML细胞株K562、K562/G、32Dp210、32Dp210-T3151增殖,呈时间和浓度梯度依赖,48小时IC50分别是：513.99、603.53、110.08、148.07 nmol/L. (2) BIIB021作用24小时后能明显诱导CML细胞发生凋亡。Caspase-3、Caspase-9和PARP激活,Bak、Bad的蛋白表达量增加,Bid、Mcl-1、 Survivin表达量减少,Bcl-2、Bcl-XL、Bax不变。(3) BIIB021能在蛋白水平抑制BCR-ABL和p-BCR-ABL的表达,而在mRNA水平没有减少,蛋白酶体抑制剂MG-132能逆转BIIB021诱导的BCR-ABL下降,而自噬溶酶体抑制剂氯喹则不能。(4) BIIB021能在蛋白水平下调磷酸化的Stat3、Stat5、Erkl/2,下调总的Jak2和Akt。 (5) BIIB021能下调3-catenin/c-Myc通路的蛋白表达量。激光共聚焦显微镜观察及分别提取胞核、胞浆蛋白,均显示BIIB021能同时减少胞核和胞浆中的β-catenin.第二部分：BIIB021对CML细胞株诱导自噬的作用及其机制目的：研究BIIB021诱导CML细胞发生自噬及其分子机制,探讨BIIB021诱导的自噬在凋亡中的作用,与自噬抑制剂联合应用,为临床CML治疗提供新的方案。方法：Monodansylcadaverine染色、吖啶橙染色后荧光显微镜观察嗜酸性小体。用携带mRFP-GFP标记LC3的腺病毒转染细胞,激光共聚焦显微镜观察自噬小体。Western-blot法检测LC3I/Ⅱ、p62、Beclin-1, mTOR-Ulk1通路蛋白水平变化。MTT法检测生长抑制作用。用携带shRNA的慢病毒转染细胞沉默Caspase-3.采用SPSS20统计处理软件分析,以p0.05作为有差别统计学意义。结果：(1)BIIB021诱导CML细胞产生自噬小体. (2)BIIB021促进LC3I向LC3II转化,减少p62和Beclin-1的表达量。(3) BIIB021通过Akt-mTOR-Ulkl通路诱导自噬。(4)BIIB021与自噬抑制剂3-methyladenine或bafilomycinA1联合应用后显著增加BIIB021诱导的CML细胞凋亡,证明BIIB021诱导保护性自噬。结论：通过一系列体外实验,证明小分子抑制剂BIIB021具有抗慢性粒细胞白血病的作用。它能激活线粒体通路诱导凋亡,并且对伊马替尼耐药株,特别是32Dp210-T315I也有明显诱导凋亡的作用。BIIB021主要通过蛋白酶体途经诱导BCR-ABL降解。除此之外,我们发现BIIB021通过Akt-mTOR-Ulkl通路诱导保护性自噬,联合应用自噬抑制剂能够增强BIIB021诱导的细胞凋亡。这些发现为临床治疗CML特别是耐药病例,提供了新的治疗方案和策略。
【关键词】：BⅡB021 慢性粒细胞白血病(CML) BCR-ABL 自噬 Ulk1
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72
【目录】：

• 致谢4-5
• 前言5-7
• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 缩略表12-14
• 第一部分：BIIB021对CML细胞株抑制生长、诱导凋亡的作用及其机制14-32
• 1.1 实验材料、仪器和试剂14-19
• 1.2 实验方法19-23
• 1.3 实验结果23-32
• 第二部分：BIIB021对CML细胞株诱导自噬的作用及其机制32-44
• 2.1 实验材料、仪器和试剂32-33
• 2.2 实验方法33-34
• 2.3 实验结果34-44
• 讨论44-47
• 小结47-48
• 参考文献48-53
• 综述53-63
• 参考文献58-63
• 作者简介63

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本文编号：969704