肽核酸靶向抑制线粒体融合逆转人肺腺癌干细胞顺铂耐药的研究

发布时间：2017-10-04 20:37

  本文关键词：肽核酸靶向抑制线粒体融合逆转人肺腺癌干细胞顺铂耐药的研究

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【摘要】：目前,肺癌发病率及死亡率逐年递增,成为严重威胁人们健康的恶性肿瘤之一。其中,肺腺癌发病率迅速增加,已取代鳞癌成为最常见的病理类型。虽然化疗仍然是治疗肺癌的重要手段之一,但目前化疗效果仍非常有限。现在普遍认为,肺癌干细胞的存在是导致肺癌患者化疗耐药、复发和转移的主要原因。线粒体是调控细胞凋亡的中心环节,是一个形态结构和细胞分布不断动态变化的器官,通过精细调节线粒体内、外膜的融合和分裂,满足细胞内各区域的能量需要、维持mt DNA稳定、保护细胞器结构完整。研究发现肿瘤干细胞中的线粒体较其余癌细胞具有更活跃的融合现象,有助于肺癌干细胞抗凋亡,有可能成为临床中真正意义上的靶点。因此寻求靶向抑制肺癌干细胞线粒体融合,逆转肺腺癌干细胞顺铂耐药,提高患者生存率,具有重要的临床意义。然而对于肺癌干细胞线粒体融合现象的研究尚处于空缺阶段,因此,本研究旨在观察肺癌干细胞线粒体融合现象且利用肽核酸靶向抑制肺癌干细胞线粒体融合,比较其抑制后的顺铂耐药情况,以期为肺癌干细胞的靶向治疗提供实验基础。目的:1.观察肺癌干细胞线粒体融合相关蛋白的表达。2.观察肺癌干细胞线粒体能量代谢的生物学特性。3.探讨肽核酸靶向抑制肺癌干细胞线粒体融合的影响。方法:采用肿瘤干细胞无血清培养基(serum-free medium,SFM)的方法将A549细胞诱导成具有干性的A549细胞球体,采用RT-PCR和Western-blot技术分别检测A549细胞及A549细胞球线粒体促融合蛋白Mitofusin1、Mitofusin2、Opa1和Atad3a的m RNA和蛋白的表达;采用流式细胞仪检测A549细胞及A549细胞球线粒体膜电位;采用激光共聚焦观察A549细胞及A549细胞球线粒体空间分布;固相肽合成法合成肽核酸-三苯磷复合物;激光共聚焦观察肽核酸-三苯磷复合物对肺癌干细胞的转染和鉴定;采用RT-PCR和Western-blot技术分别检测肽核酸-三苯磷复合物转染肺癌干细胞后干扰mt DNA基因表达情况;Western-blot技术检测线粒体融合相关蛋白的表达情况,同时检测肽核酸-三苯磷复合物转染A549细胞球及A549细胞后ATP含量的变化;流式细胞仪检测各组细胞凋亡,线粒体膜电位指标。结果:A549细胞球中线粒体促融合蛋白Mfn 1、Mfn2 2、Opa1和Atad3a分子的m RNA和蛋白的表达均较A549细胞明显升高;A549细胞球中线粒体绕核分布且线粒体膜电位较A549普通细胞高;肽核酸-三苯磷复合物作用于A549细胞球及A549细胞线粒体融合后,线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2和Opa1蛋白的表达均下降,而Atad3a的表达则无明显变化,同时伴有2组细胞ATP含量的明显下降;A549细胞球凋亡率较A549细胞明显升高,而线粒体膜电位则明显下降。结论:1.A549肺癌细胞球的线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1、Atad3a的蛋白和m RNA表达较A549细胞明显升高。2.肽核酸-三苯磷复合物积聚于高?ψm的A549肺癌细胞球线粒体内,封闭mt DNA双链启动子共有序列基因的表达,干扰能量代谢,抑制线粒体融合,诱导细胞凋亡,增强A549肺癌细胞球顺铂化疗敏感性。
【关键词】：肺癌干细胞 线粒体融合 靶向抑制 抗凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文缩略词表10-12
• 第1章 引言12-15
• 第2章 材料与方法15-27
• 2.1 实验材料15-19
• 2.1.1 细胞株15
• 2.1.2 主要试剂及来源15-16
• 2.1.3 主要仪器和设备16
• 2.1.4 主要试剂配制16-19
• 2.2 实验方法19-26
• 2.2.1 A549细胞球线粒体融合相关蛋白表达的研究19-23
• 2.2.2 A549细胞球线粒体分布及膜电位检测23
• 2.2.3 肽核酸-三苯磷复合物干扰肺癌干细胞线粒体融合的研究23-26
• 2.3 统计方法26-27
• 第3章 结果27-37
• 3.1 Western blot法及RT-PCR法检测Mfn1、Mfn2、Opa1和Atad3a蛋白及m RNA的表达27-28
• 3.2 LSCM观察线粒体分布28-29
• 3.3 流式细胞仪检测两组细胞中线粒体膜电位29-30
• 3.4 肽核酸-三苯磷复合物的鉴定30
• 3.5 肽核酸-三苯磷复合物在A549细胞球及A549细胞内的空间分布30-31
• 3.6 Western blot和RT-PCR法检测肽核酸-三苯磷复合物转染A549细胞球和A549细胞后mt DNA重链编码基因ATP6及mt DNA轻链编码基因ND6蛋白和m RNA的表达31-32
• 3.7 Western blot法检测肽核酸-三苯磷复合物转染A549细胞球和A549细胞线粒体融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1和Atad3a的表达32-33
• 3.8 肽核酸-三苯磷复合物转染A549细胞球和A549细胞后ATP浓度检测33-34
• 3.9 FCM法检测肽核酸-三苯磷复合物对A549细胞球及A549细胞凋亡和?ψm的影响34-37
• 第4章 讨论37-42
• 第5章 结论与展望42-43
• 5.1 结论42
• 5.2 展望42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-46
• 攻读学位期间的研究成果46-47
• 综述47-55
• 参考文献53-55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 Tae Il Kim;;Chemopreventive drugs:Mechanisms via inhibition of cancer stem cells in colorectal cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2014年14期

2 孙芬芬;贺斌峰;余时沧;黄学德;叶小群;;A549肺癌细胞球抗凋亡能力及耐药蛋白表达分析[J];肿瘤;2011年02期

3 王光辉;黄桂君;余时沧;张志远;钱桂生;;反义肽核酸阻抑线粒体基因表达诱导肺癌SPC细胞凋亡的实验研究[J];重庆医科大学学报;2009年11期

4 姚珂,闵家新,张国强,余祖滨;反义端粒酶PNA对肺癌细胞株生长的体外抑制作用[J];中国肺癌杂志;2004年03期

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本文编号：972734