Notch2在细胞分裂阻滞后命运调控中的功能研究

发布时间：2017-10-05 14:30

  本文关键词：Notch2在细胞分裂阻滞后命运调控中的功能研究

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【摘要】：目前癌症已经发展成为严重威胁人类健康的疾病之一,癌症控制和治疗已成为全球性的医学战略重点。长期以来,针对肿瘤细胞无限增殖这一特点,紫杉醇(Taxol)、长春碱(vinblastine)等抗有丝分裂药物被用于肿瘤的临床治疗。紫杉醇等抗有丝分裂化疗药物的使用,会干扰细胞内微管的正常功能,破坏纺锤体的形成,从而使细胞发生有丝分裂阻滞,进而引起细胞的凋亡。抗有丝分裂药物即是根据这一原理杀死肿瘤细胞从而达到肿瘤治疗的目的。然而近年来的研究结果显示,紫杉醇等抗有丝分裂化疗药物引起细胞发生有丝分裂阻滞后,除了在分裂期凋亡这一命运外,绝大多数细胞会有另外两种命运走向,即不正常分裂形成非整倍体和阻滞后退出有丝分裂而进入下一间期。如何提高有丝分裂阻滞后凋亡细胞的比例,降低阻滞后其他非凋亡命运走向的细胞比例成为亟待解决的问题。关于细胞有丝分裂期间的研究,目前大多数的研究侧重于有丝分裂期间细胞内蛋白质的修饰和降解,新合成的蛋白质的研究却很少得到关注。本研究采用近年来基于高通量测序开发并逐渐完善的Ribosome Profiling技术,对正常分裂期和分裂阻滞后的细胞进行全基因组翻译水平上的测序,整理分析得到一些阻滞后有差异翻译的基因,并对一些差异翻译的重点基因进行筛选鉴定。Notch2是阻滞后差异翻译的基因之一,属于Notch家族,与细胞的增殖、凋亡及个体的发育都有密切的关系。本研究重点对Notch2在有丝分裂阻滞细胞命运决定中的功能以及Taxol阻滞后Notch2上游活化配体等展开了研究。研究结果显示,与正常分裂期相比,Taxol阻滞后Notch2在蛋白水平上发生了明显上调,Notch2在分裂阻滞期的蛋白质合成增加,验证了本研究测序结果的正确性和可靠性。对Notch2进行敲低后,活细胞和免疫荧光结果显示Notch2的敲低对细胞有丝分裂进程并没有影响。发生分裂阻滞后,与正常细胞相比Notch2敲低的细胞在下一个间期死亡的概率明显增加。这个结果暗示着Notch2可能在下个G1期细胞的存活过程中发挥作用。细胞周期各时期Notch2蛋白水平检测结果显示,在分裂期和分裂阻滞期细胞中切割活化的Notch2发生了修饰后降解。另外,Notch2下游分子Hes1 mRNA水平在分裂期和分裂阻滞期细胞中明显低于G1、S期,Notch2在分裂期和分裂阻滞期对下游分子的转录活性很低。分裂阻滞后Notch2主要是在不正常分裂后下一个G1期发挥作用而并非在分裂阻滞期发挥作用。Notch2的敲低会使Hela细胞中周期蛋白cyclinD1 mRNA水平明显降低,分裂阻滞后敲低Notch2可能会通过抑制cyclinD1的表达,使细胞发生G1期阻滞,进而加剧不正常分裂后细胞在下一个G1期的死亡。敲低Notch2会抑制Taxol阻滞后周期蛋白p27Kipl mRNA水平的升高,可能会影响Taxol阻滞后细胞发生G1期阻滞的概率。对于抗凋亡分子Mcl-1和Bcl2, Notch2的敲低会抑制Taxol阻滞后Mcl-1、Bcl2 mRNA水平的升高,进而可能促进不正常分裂后下一个G1期细胞的死亡。最后,本研究中对Taxol阻滞后Notch2可能的活化配体进行了研究,发现Hela细胞中Taxol阻滞后Notch2可能的活化配体为JAG1,并对JAG1 shRNA进行了筛选,可用于后续JAG1敲低的功能实验。
【关键词】：有丝分裂阻滞 阻滞后细胞命运 Notch2
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.53
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-34
• 1.1. 肿瘤概述12-21
• 1.1.1. 维持增殖信号12-13
• 1.1.2. 生长抑制因子的缺失13-14
• 1.1.3. 抗凋亡特性14-15
• 1.1.4. 无限复制能力15-16
• 1.1.5. 诱导血管发生16
• 1.1.6. 肿瘤迁移和浸润16-17
• 1.1.7. 肿瘤细胞中基因突变多发以及基因组的不稳定性17-18
• 1.1.8. 肿瘤细胞的代谢重编程18-19
• 1.1.9. 肿瘤的免疫逃逸19-20
• 1.1.10. 肿瘤和炎症反应20-21
• 1.2. 肿瘤治疗概述21-22
• 1.3. 抗有丝分裂类药物用于肿瘤治疗研究22-25
• 1.3.1. 抗有丝分裂化疗药物概述22-23
• 1.3.2. 纺锤体检查点和有丝分裂阻滞23-24
• 1.3.3. 抗有丝分裂类化疗药物临床应用现状24-25
• 1.4. 有丝分裂阻滞后细胞命运研究25-29
• 1.4.1. 概述25-26
• 1.4.2. 分裂期死亡(mitotic cell death)26-27
• 1.4.3. Slippage27
• 1.4.4. 不正常分裂(Abnormal mitosis)27-28
• 1.4.5. 分裂阻滞后细胞不同命运走向解释模型28
• 1.4.6. 尚待解决的问题28-29
• 1.5. Ribosome profiling29-30
• 1.6. Notch2概述30-34
• 1.6.1. Notch信号通路30-31
• 1.6.2. Notch2与肿瘤研究现状31-32
• 1.6.3. Notch2与细胞周期32
• 1.6.4. Notch2与细胞凋亡32-34
• 第二章 实验材料与方法34-48
• 2.1. 实验材料34-35
• 2.1.1. 实验试剂34-35
• 2.1.2. 实验器材35
• 2.2. 实验方法35-48
• 2.2.1. Hela细胞的培养35-36
• 2.2.2. 不同时期Hela细胞的收获36-37
• 2.2.3. 细胞total RNA抽提37
• 2.2.4. 逆转录反应37-38
• 2.2.5. 实时荧光定量PCR38-40
• 2.2.6. 蛋白质免疫印迹(Western blot)40-43
• 2.2.7. 慢病毒包装和感染43-44
• 2.2.8. 稳定细胞株筛选44-45
• 2.2.9. 免疫荧光(Immunofluorescence)45-46
• 2.2.10. 活细胞拍摄46-48
• 第三章 实验结果与分析48-62
• 3.1. 不同时期Hela细胞的收获48
• 3.2. Ribosome profiling差异翻译基因48-49
• 3.3. Taxol阻滞后Notch2蛋白水平检测49-50
• 3.4. Notch2稳定细胞株敲低效果检测50-51
• 3.5. Notch2敲低对细胞有丝分裂进程影响研究51-53
• 3.6. Notch2敲低对Taxol阻滞后细胞命运影响研究53-55
• 3.7. 各时期Notch2蛋白水平检测55-57
• 3.8. 细胞周期相关分子p27Kip1,CyclinD1 mRNA水平检测57-58
• 3.9. 凋亡相关分子Mcl-1和Bcl-2 mRNA水平检测58-59
• 3.10. Hela细胞中阻滞后Notch2配体检测59-62
• 第四章 总结与讨论62-66
• 参考文献66-72
• 致谢72

【共引文献】

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本文编号：977330