miR-27a介导二甲双胍抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的机制研究

发布时间：2017-10-06 15:23

  本文关键词：miR-27a介导二甲双胍抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖作用的机制研究

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【摘要】：目的:近年来,乳腺癌的发病率正以惊人速度上升,已经逐渐成为人类最常见的恶性肿瘤之一。大量的研究证实,糖尿病能够增加乳腺癌的患病风险,且与预后相关,临床上两种疾病常同时存在。二甲双胍作为指南中一线降糖药物,已广泛用于2型糖尿病患者。近年来,大量的流行病学资料显示,二甲双胍可以降低乳腺癌的发病率,并有助于提高乳腺癌患者的预后。micro RNAs(mi RNAs)是近年来揭示出的一组非编码的小分子单链RNA,长度约为19-25个核苷酸,通过在转录后水平调控其靶基因的表达和/或抑制靶蛋白的翻译来实现其生理作用。研究证实,mi RNAs与肿瘤密切相关,在肿瘤发生以及发展过程中扮演着十分关键的角色。研究证实,micro RNA27a(mi R-27a)有原癌基因活性,在乳腺癌,胃癌,结肠癌,子宫内膜癌等多种肿瘤细胞中呈高表达状态。mi R-27a参与乳腺癌细胞凋亡及细胞周期的调控等。近年来,国外学者研究发现,在乳腺癌组织及乳腺癌细胞MCF-7中,AMPKα2因子表达受到广泛抑制,AMPKα2具有肿瘤抑制因子的作用。而至于AMPKα2 m RNA表达下调的机制尚不清楚,因此本研究尝试从micro RNA与其靶基因之间的作用关系解释此现象,初步预测AMPKα2可能是mi R-27a的下游靶基因,进而从mi RNAs水平探讨二甲双胍治疗乳腺癌的新型作用机制。方法:1.以不同浓度(1mmol/L,2mmol/L,5mmol/L,10 mmol/L,20 mmol/L)的二甲双胍分别干预人乳腺癌细胞MCF-7,作用48小时后,用MTT法检测不同浓度组MCF-7细胞的OD值,计算细胞增殖抑制率。2.以20mmol/L的二甲双胍分别干预MCF-7细胞不同的时间(12h,24h,36h,48h,72h),用MTT法检测不同时间组MCF-7细胞的OD值,计算细胞增殖抑制率。3.将细胞分为对照组和干预组,干预组以20mmol/L的二甲双胍干预MCF-7细胞48小时,用荧光定量PCR方法检测mi R-27a及AMPKα2m RNA表达水平,Western Blotting方法检测AMPKα2及凋亡因子caspase-3蛋白表达水平。4.将细胞分为6组:对照组,脂质体lipo2000组(lipo2000组),转染mi R-27a mimics组(mi R-27a mimics组),转染mi R-27a inhibitor组(inhibitor组)及转染其各自阴性对照组(mi R-27a N.C组、inhibitor N.C组)。转染后作用48小时,用荧光定量方法检测mi R-27a及AMPKα2 m RNA表达水平,Western Blotting方法检测AMPKα2及caspase-3蛋白表达水平。MTT法检测每组细胞的OD值,根据平均值计算细胞增殖抑制率。结果:1.测得不同浓度组的平均OD值表明,随着二甲双胍浓度的增高,各组平均OD值呈下降趋势。单因素方差分析结果显示,不同浓度二甲双胍作用后,各组平均OD值之间相比具有统计学差异(P0.05)。2.20mmol/L二甲双胍干预MCF-7细胞,随着作用时间的延长,细胞生长明显被抑制。单因素方差分析结果显示,二甲双胍作用36小时,48小时,72小时后,均较作用12小时组出现明显差异(P0.05)。3.20mmo/L的二甲双胍干预48小时后,荧光定量PCR结果显示mi R-27a表达明显下调,而AMPKα2 m RNA表达量较对照组明显增加,有显著性差异(P0.05)。Western Blotting实验结果显示,AMPKα2蛋白水平在干预组表达增加,差异有统计学意义(P0.05)。同时,干预组cleaved caspase-3蛋白表达水平较对照组明显增高,有统计学差异(P0.05)。4.转染mi R-27a mimics组,其mi R-27a表达显著增高;转染inhibitor组,其mi R-27a表达明显受到抑制,而lipo2000组、mi R-27a N.C组和inhibitor N.C组均未引起mi R-27a表达水平的变化(P0.05)。5.mi R-27a mimics组AMPKα2 m RNA表达水平明显下降(P0.05),且具有浓度依赖性;inhibitor组AMPKα2 m RNA表达水平则呈浓度依赖性提高(P0.05),lipo2000组、mi R-27a N.C组和inhibitor N.C组均未引起明显的AMPK m RNA表达水平的变化(P0.05)。Western Blotting实验结果也证实,mi R-27a mimics组AMPKα2蛋白水平表达降低,而inhibitor组则表达水平升高,两者的变化都较对照组有统计学差异(P0.05)。6.Western Blotting实验结果表明,mi R-27a mimics组caspase-3蛋白水平表达降低,而inhibitor组caspase-3蛋白表达水平升高,且两组之间的变化有统计学差异(P0.05)。7.MTT结果表明,mi R-27a mimics组OD值平均水平明显高于其他五组,细胞增殖抑制率明显下降;而inhibitor组其OD值平均水平最低,细胞增殖抑制率最高,且两组之间的变化有统计学差异(P0.05)。结论:1.二甲双胍能够抑制MCF-7细胞生长,且呈浓度依赖和时间依赖。2.二甲双胍可能通过下调mi R-27a的水平,进而上调AMPKα2表达,进一步激活caspase-3,最终导致MCF-7细胞凋亡。3.AMPKα2可能为mi R-27a的下游靶基因。
【关键词】：二甲双胍 MCF-7 细胞凋亡 miR-27a AMPKα2 caspase-3 靶基因
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语/符号说明13-15
• 前言15-17
• 研究现状、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、二甲双胍对人乳腺癌细胞MCF-7 作用的实验研究17-25
• 1.1 对象和方法17-19
• 1.1.1 实验材料17-18
• 1.1.1.1 细胞系17
• 1.1.1.2 主要试剂17
• 1.1.1.3 主要仪器17-18
• 1.1.2 实验方法18-19
• 1.1.2.1 细胞培养方法18-19
• 1.1.2.2 MTT法检测二甲双胍对MCF-7 细胞增殖的影响19
• 1.1.3 统计学方法19
• 1.2 结果19-21
• 1.2.1 二甲双胍干预后MCF-7 细胞形态学的变化19-20
• 1.2.2 二甲双胍抑制乳腺癌细胞生长具有浓度依赖性20
• 1.2.3 二甲双胍抑制乳腺癌细胞生长具有时间依赖性20-21
• 1.3 讨论21-24
• 1.3.1 二甲双胍对MCF-7 细胞的增殖作用的影响21-22
• 1.3.2 二甲双胍治疗乳腺癌的可能机制22-24
• 1.4 小结24-25
• 二、mi R-27a及AMPKα2 在二甲双胍干预人乳腺癌细胞MCF-7 增殖中的作用25-46
• 2.1 对象和方法25-33
• 2.1.1 实验材料25-27
• 2.1.1.1 主要试剂25-26
• 2.1.1.2 主要仪器26
• 2.1.1.3 试剂的配置26-27
• 2.1.2 实验方法27-33
• 2.1.2.1 二甲双胍干预MCF-7 细胞27
• 2.1.2.2 总RNA提取的步骤27-28
• 2.1.2.3 实时荧光定量PCR检测miR-27a表达的变化28
• 2.1.2.4 实时荧光定量PCR检测AMPKα2 mRNA表达的变化28-29
• 2.1.2.5 总蛋白的提取及浓度测定29-30
• 2.1.2.6 Western Blotting检测步骤30-32
• 2.1.2.7 不同的RNA oligo片段转染MCF-7 细胞32
• 2.1.2.8 MTT法检测转染不同RNA oligo片段后MCF-7 增殖情况32-33
• 2.1.3 统计学方法33
• 2.2 结果33-40
• 2.2.1 二甲双胍可使mi R-27a表达降低，AMPKα2 在m RNA和蛋白水平表达升高33-34
• 2.2.2 二甲双胍可激活caspase-3 分解，使裂解的caspase-3 表达增多34-35
• 2.2.3 转染效率检测35-36
• 2.2.4 转染miR-27a mimics片段使得AMPKα2 因子表达降低；转染mi R-27ainhibitor片段，，使AMPKα2 因子表达上调36
• 2.2.5 转染阴性对照并未引起miR-27a表达变化，也未引起AMPKα2 表达的变化36-37
• 2.2.6 各组AMPKα2 在蛋白质水平的变化与mRNA变化结果相一致37-38
• 2.2.7 过表达miR-27a，caspase-3 表达减少；沉默miR-27a则caspase-3 表达高38-39
• 2.2.8 MTT结果表明，过表达miR-27a能够促进MCF-7 细胞的生长39-40
• 2.3 讨论40-45
• 2.3.1 mi RNAs与肿瘤40-41
• 2.3.1.1 miRNAs概述40
• 2.3.1.2 miR-27a与乳腺癌40-41
• 2.3.2 AMPKα2 与肿瘤41-43
• 2.3.2.1 AMPK通路的概述41
• 2.3.2.2AMPKα2 在乳腺癌细胞增殖和细胞凋亡中的研究41-43
• 2.3.3 caspase家族与肿瘤43-44
• 2.3.4 P53与肿瘤44-45
• 2.4 小结45-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 发表论文和参加科研情况说明51-52
• 综述 miR-27a研究进展52-65
• 综述参考文献60-65
• 致谢65

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