下调HOTAIR表达对结直肠癌及其癌干细胞侵袭、转移和致瘤性的影响

发布时间：2017-10-08 05:31

  本文关键词：下调HOTAIR表达对结直肠癌及其癌干细胞侵袭、转移和致瘤性的影响

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【摘要】：结直肠癌起源于粘膜上皮或粘膜下间叶组织,是由结直肠粘膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶变,是最常见的消化道恶性肿瘤之一。在各类恶性肿瘤中,结直肠癌的发病率居第三位,占胃肠道肿瘤的第二位。结直肠癌治疗以手术、放化疗为主,因其极易侵犯血管、淋巴结转移甚至远处而增加了根治的难度。结直肠癌是上皮源性的肿瘤,上皮细胞之所以恶性病变进而转移,可能涉及到上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)。近年来,非编码RNA作为表观遗传学研究内容之一,从小RNA到长链非编码RNA (LncRNA),在肿瘤中已被广泛探究。HOX transcript antisense RNA (HOTAIR)作为LncRNA大家族的成员之一,在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和结直肠癌等肿瘤中已有较多的研究报道。尽管如此,HOTAIR在结直肠癌及其癌干细胞(cancer stem cells, CSCs)中的分子生物学特性仍知之甚少。本研究选择人结直肠癌细胞系LoVo细胞系作为研究对象,针对HOTAIR编码基因设计合成小发夹RNA(small hairpin RNA),利用RNAi的方法,将构建好的真核ShRNA表达载体,稳定转染至LoVo细胞,来降低HOTAIR表达水平,并分选出结直肠癌CSCs,通过检测细胞生物学特性改变,探讨HOTAIR是否可作为结直肠癌CSCs治疗的新靶点。目的：探讨抑制结人结直肠癌LoVo细胞及其CSCs中HOTAIR的表达,对癌细胞增殖、侵袭、转移和致瘤性的影响,为进行以HOTAIR为靶点的结直肠癌治疗提供依据。方法：以Superior-EGFP1为载体构建的ShRNA重组质粒,通过脂质体转染LoVo细胞,经G418筛选稳定转染细胞株后,用QRT-PCR检测HOTAIR的表达。通过LoVo细胞体外增殖能力、耐药能力、克隆形成能力、转移侵袭能力、体内致瘤性等实验,综合分析下调HOTAIR表达后对LoVo细胞生物学特性的影响。进而,通过免疫磁珠分选出结直肠癌CSCs,用上述方法及免疫组化和Western Blot方法对其侵袭、转移和致瘤性以及上皮间质转化(EMT)相关分子表达做进一步分析。结果：1.RT-PCR检测证实在结直肠癌细胞LoVo中存在HOTAIR的表达；结直肠癌CSCs高表达HOTAIR,与LoVo细胞相比,差异有显著性意义(P0.05)。2.构建的真核重组表达载体经脂质体转染LoVo细胞,经G418成功筛选出稳定表达的细胞株。QRT-PCR检测结果表明,构建的HOTAIR-ShRNA对HOTAIR的表达有一定的抑制作用。3.通过划痕实验、侵袭实验、平板克隆形成实验、体外增殖实验、耐药实验和致瘤实验结果分析,HOTAIR-ShRNA转染的LoVo细胞,其迁移与侵袭性、体外增殖能力、耐药性、克隆形成能力以及在裸鼠体内的致瘤性均有所下降,与Scramble-ShRNA转染的LoVo细胞及野生型细胞相比,差异有显著性意义(P0.05或P0.01)。此外,Western Blot证明,下调HOTAIR后可增加细胞中E-钙黏蛋白表达,降低波形蛋白的表达。4.经免疫磁珠分选出CD133阳性的结直肠癌CSCs,转染HOTAIR-ShRNA后，，与野生型及Scramble-ShRNA质粒转染的CSCs相比,细胞的迁移与侵袭性、体外增殖能力、耐药性、克隆形成能力以及在小鼠的致瘤性有明显所下降,差异有显著性意义(P0.05或P0.01)。免疫组化和Western Blot分析结果同时证明,转染HOTAIR-ShRNA的结直肠癌CSCs,所致的裸鼠肿瘤及肺组织中EMT相关分子表达发生改变,即E-钙黏蛋白表达升高,波形蛋白表达降低,与Scramble-ShRNA转染的LoVo细胞及野生型细胞所致的裸鼠肿瘤及肺组织组相比,差异有显著性意义(P0.05)。结论：1.降低人结直肠癌LoVo细胞中HOTAIR的表达,可在一定程度上降低LoVo细胞在体外的克隆形成能力、增殖能力、耐药性、侵袭转移能力及体内致瘤能力,抑制LoVo细胞发生EMT。2.下调HOTAIR表达可减弱结直肠癌CD133+CSCs侵袭转移性和致瘤性,提示HOTAIR可能是结直肠癌治疗的新靶点。
【关键词】：结直肠癌 HOTAIR 癌干细胞 RNA干扰 上皮间质转化 靶向治疗
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 符号、变量、缩咯词等本论文专用术语的注释表9-12
• 绪论12-13
• 综述 结直肠癌的EMT与HOTAIR的研究概况13-22
• Reference18-22
• 第一部分 下调HOTAIR在人结直肠癌LoVo细胞中的表达及单克隆筛选22-33
• 引言22
• 材料与方法22-28
• 实验结果28-32
• 讨论32-33
• 第二部分 HOTAIR-shRNA对人结直肠癌LoVo细胞增殖、侵袭转移和致瘤性的影响33-48
• 引言33
• 材料与方法33-39
• 实验结果39-47
• 讨论47-48
• 第三部分 下调HOTAIR表达对结直肠癌干细胞侵袭、转移和致瘤性的影响48-62
• 引言48
• 材料与方法48-50
• 实验结果50-60
• 讨论60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-64
• 致谢64-65
• 个人简介65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：992285