恶性黑色素瘤中miR-506的表达及其生物学意义

发布时间：2017-10-08 08:25

  本文关键词：恶性黑色素瘤中miR-506的表达及其生物学意义

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【摘要】：目的恶性黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤,好发于皮肤及黏膜,预后不佳。转移性恶性黑色素瘤的预后极差,中位生存期仅为7.5个月。目前,在中国恶性黑色素瘤的发病率和死亡率均呈快速上升的趋势。传统的放化疗对转移性恶性黑色素瘤的疗效并不理想,而分子靶向治疗如维罗非尼等药物在延长患者生存期方面展现出明显的优势,抗CTLA-4及PD-1/PD-L1等免疫治疗目前已取得了巨大成功。但仍有许多分子靶向药物仍在临床试验阶段,临床获益并不明确。Micro RNAs(miRNAs)是一组非编码的小RNA,可调控人类基因组约30%的基因,在肿瘤中发挥抑癌基因或促癌基因的作用。相关研究表明,miR-506在卵巢癌、乳腺癌、胃癌等上皮源性肿瘤和间叶来源的骨肉瘤中均有抑制肿瘤进展的作用,但其在恶性黑色素瘤中的作用尚不明确。因此,本研究旨在探讨miR-506在恶性黑色素瘤组织中的表达及其临床意义,同时探索其与DNA损伤同源重组信号通路和间叶上皮转化(Mesenchymal to epithelial transition,MET)之间的关系,为明确miR-506在恶性黑色素瘤中的生物学意义提供依据。方法本研究选取从1981年2月到2013年5月在天津医科大学肿瘤医院就诊并由病理确诊为恶性黑色素瘤的776例患者,并对每位患者的临床病例资料进行收集、整理及生存状态的随访。应用实时定量PCR技术检测选用其中的48例新鲜恶性黑色素瘤组织(16例肿瘤组织和有配对的正常组织)中miR-506的表达水平并对miR-506的表达进行差异性分析。从病理科获取147例恶性黑色素瘤的福尔马林固定石蜡包埋(Formalin fixed paraffin embedded,FFPE)肿瘤组织,制成组织芯片(Tissue microarray,TMA)进行组织样本的实验,应用免疫组化SP染色方法检测DNA损伤同源重组相关蛋白(RAD51 recombinase,RAD51;RAD52 homolog,DNA repair protein,RAD52;ATM serine/threonine kinase,ATM)及MET相关蛋白(E-cadherin,N-cadherin,Vimentin和Slug)在组织芯片中的表达,分别分析两组蛋白间表达的相关性。采用卡方检验分析miR-506、相关蛋白指标以及患者临床病理特征之间相关性。采用Kaplan-Meier法分析miR-506表达水平和各相关蛋白的表达水平对恶性黑色素瘤患者的总生存期及无进展生存期的影响。过表达或抑制miR-506后在人恶性黑色素瘤细胞系A375和A875中,通过3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)、Transwell小室等细胞功能实验来观察miR-506对恶性黑色素瘤细胞的增殖、迁移及侵袭性的影响;用Western blot方法来进一步观察miR-506对DNA损伤修复同源重组相关蛋白(RAD51)及MET相关蛋白(N-cadherin,Slug和Vimentin)表达的影响。结果1.实时定量PCR的结果显示,miR-506在恶性黑色素瘤肿瘤组织中的表达水平高于正常组织的表达水平(n=64,P=0.006),且miR-506高表达的恶性黑色素瘤患者的总生存、无病生存及无进展生存时间均优于低表达的患者(OS:n=48,P=0.002,DFS:n=32,P0.001,PFS:n=35,P=0.039)。miR-506在转移性恶性黑色素瘤患者中的表达显著低于原发病变的患者(P=0.049)。2.在恶性黑色素瘤中RAD51蛋白的阳性表达率为56.5%,ATM的阳性表达率为53.7%,二者之间的阳性表达呈正相关性(r=0.396,P0.001)。而RAD52的阳性表达率为45.6%,且同RAD51和ATM的阳性表达则分别呈负相关(r=-0.253,P=0.002;r=-0.219,P=0.008)。miR-506的表达同RAD51表达成负相关(r=-0.467,P=0.001)。3.Vimentin,N-cadherin,Slug和E-cadherin在恶性黑色素瘤中的阳性表达率分别为72.1%,36.1%,40.1%和29.3%。相关性检验可知,N-cadherin的阳性表达同Vimentin和Slug的阳性表达成正相关(r=0.246,P=0.003;r=0.281,P=0.001),而同E-cadherin的阳性表达成负相关(r=-0.327,P0.001),Vimentin的阳性表达同Slug的阳性表达之间也成正相关(r=0.385,P0.001)。miR-506的表达同Vimentin和Slug表达分别成负相关(r=-0.377,P=0.008;r=-0.358,P=0.012)。4.RAD51、ATM和N-cadherin阳性表达的患者临床预后较阴性表达的患者差,而RAD52和E-cadherin阳性表达的患者预后较好。Cox回归分析可得RAD51、RAD52和E-cadherin的蛋白表达可视为患者评估预后的独立因子(P=0.025,HR=2.41;P=0.008,HR=0.37;P=0.003,HR=0.21)。5.在恶性黑色素瘤细胞系A375和A875中MTT和Transwell小室实验结果显示:过表达miR-506可显著抑制恶性黑色素瘤细胞的增殖,迁移及侵袭;抑制miR-506可促进恶性黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。6.在恶性黑色素瘤细胞系中过表达miR-506可引起Vimentin、N-cadherin、Slug和RAD51蛋白的表达显著下调的功能。7.在恶性黑色素瘤细胞系中抑制miR-506,未见其对Vimentin、N-cadherin、Slug和RAD51蛋白的表达有明显调控功能。结论恶性黑色素瘤中miR-506的表达与患者的预后相关。miR-506可下调RAD51的表达,调控DNA损伤同源重组通路,对肿瘤细胞的增殖有一定的抑制作用;亦可下调Vimentin、N-cadherin和Slug的表达,调控间叶上皮转化通路,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。由此可知,在恶性黑色素瘤中miR-506可能发挥“保护”的作用。
【关键词】：恶性黑色素瘤 miR-506间叶上皮转化 E-钙黏连蛋白 RAD51重组酶
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-13
• 前言13-17
• 研究现状、成果13-15
• 研究目的、方法15-17
• 1 对象和方法17-35
• 1.1 研究对象17
• 1.1.1 组织样本17
• 1.1.2 细胞株17
• 1.2 实验材料17-21
• 1.2.1 实验试剂17-18
• 1.2.2 实验仪器18-19
• 1.2.3 溶液配制19-21
• 1.3 研究方法21-33
• 1.3.1 临床样本收集与保存21
• 1.3.2 组织样本RNA的提取21-22
• 1.3.3 实时定量PCR检测miR-506在恶性黑色素瘤组织中的表达22-24
• 1.3.4 恶性黑色素瘤样本组织芯片的构建24
• 1.3.5 免疫组织化学染色检测蛋白表达24-26
• 1.3.6 细胞学实验26-33
• 1.4 病历资料随访33-34
• 1.5 统计分析34-35
• 2 结果35-64
• 2.1 恶性黑色素瘤的临床特征及预后因素35-44
• 2.1.1 恶性黑色素瘤的一般临床特征及预后35-37
• 2.1.2 皮肤型恶性黑色素瘤的一般临床特征及其预后37
• 2.1.3 黏膜型恶性黑色素瘤的一般临床特征及其预后37-44
• 2.2 恶性黑色素瘤组织样本中miR-506的表达分析及预后意义44-48
• 2.2.1 恶性黑色素瘤组织样本中miR-506的表达分析44
• 2.2.2 miR-506与恶性黑色素瘤患者临床资料的相关分析44-46
• 2.2.3 miR-506在恶性黑色素瘤中的预后意义46-48
• 2.3 DNA损伤同源重组相关蛋白在恶性黑色素瘤组织中的表达及临床意义48-52
• 2.3.1 DNA损伤同源重组相关蛋白在恶性黑色素瘤组织中的表达及临床相关分析48-50
• 2.3.2DNA损伤同源重组相关蛋白在恶性黑色素瘤组织中的临床意义50-52
• 2.3.3miR-506与DNA损伤同源重组相关蛋白表达的相关性分析52
• 2.4 间叶-上皮转化(MET)相关蛋白在恶性黑色素瘤组织中的表达及临床意义4052-59
• 2.4.1 间叶-上皮转化(MET)相关蛋白在恶性黑色素瘤组织中的表达及临床相关分析52-53
• 2.4.2 间叶-上皮转化(MET)相关蛋白在恶性黑色素瘤组织中的临床意义53-58
• 2.4.3 miR-506与间叶-上皮转化(MET)相关蛋白表达的相关性分析58-59
• 2.5 miR-506在恶性黑色素瘤细胞系中功能实验的研究59-64
• 2.5.1 miR-506对细胞增殖的影响59-60
• 2.5.2 miR-506对细胞迁移和侵袭的影响60-62
• 2.5.3 miR-506对恶性黑色素瘤细胞间叶-上皮转化(MET)相关蛋白及RAD51蛋白表达水平的影响62-64
• 3 讨论64-68
• 3.1 miR-506 在恶性黑色素瘤中的表达及预后意义64-65
• 3.2 miR-506 在恶性黑色素瘤中同 DNA 损伤同源重组修复蛋白的关系65-66
• 3.3 miR-506 在恶性黑色素瘤中同间质上皮转化相关蛋白的关系66-67
• 3.4 miR-506抑制恶性黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭67-68
• 4 结论68-70
• 参考文献70-76
• 发表论文和参加科研情况说明76-77
• 综述 miR-506在肿瘤中作用机制的研究进展77-90
• 综述参考文献84-90
• 致谢90-91
• 个人简历91

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 Meng-Ze Hao;Wen-Ya Zhou;Xiao-Ling Du;Ke-Xin Chen;Guo-Wen Wang;Yun Yang;Ji-Long Yang;;Novel anti-melanoma treatment:focus on immunotherapy[J];Chinese Journal of Cancer;2014年09期

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本文编号：992991