负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究

发布时间：2017-10-08 08:30

  本文关键词：负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源肿瘤干细胞杀伤作用的初步研究

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【摘要】：【目的】研究结肠癌干细胞来源的gp96-肽复合物冲击树突细胞(DC)后,与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共培养,探讨其对结肠癌干细胞的杀伤效果。为进一步研究奠定基础。【内容】论文首先采用3种方法检测常规培养的结肠癌细胞HT29中是否存在肿瘤干细胞(CSC),三种方法分别是:双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29细胞中侧群细胞(SP)的比例,流式细胞仪分析HT29贴壁细胞中CD133+细胞的比例,应用Western blotting检测其ALDH1蛋白表达情况;确认存在CSC后利用无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌干细胞,并于显微镜下观察其成球状况及形态学特征;利用流式仪(检测HT29微球中CD133+细胞比例)、Western blotting(检测ALDH1蛋白表达情况)及克隆形成试验对HT29结肠癌干细胞的富集效果进行检测,并进行统计学分析。继而,从HT29微球中提取细胞总蛋白后,通过硫酸铵分级盐析,经Con A亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物备用;从脐血中分离单个核细胞,分别培养DC和CIK,用纯化的gp96-肽复合物冲击DC,与CIK共培养,采用LDH法检测gp96-肽复合物冲击DC-CIK细胞对结肠癌CSC的杀伤活性,其结果用统计学方法分析。【方法】1.用双苯酰亚胺33342荧光染料检测常规培养HT29细胞中侧群细胞的比例,利用流式、Western blotting分别检测HT29贴壁细胞CD133+细胞的比例及ALDH1蛋白表达情况。2.使用添加多种因子的无血清培养基富集HT29结肠癌干细胞,显微镜下观察微球规则后,胰酶消化,制备单细胞悬液进行传代。3.HT29结肠癌干细胞富集效果的检测:采用流式细胞术检测HT29微球中CD133的表达,Western blotting检测HT29微球中ALDH1的表达;克隆形成试验检测HT29微球的克隆形成能力。4.将从结肠癌细胞HT29微球中提取的总蛋白通过硫酸铵分级盐析后,经Con A亲和层析、DEAE离子交换层析纯化gp96-肽复合物,并通过SDS-PAGE、蛋白免疫印迹对其进行鉴定,利用BCA法测定各步所得蛋白的浓度。5.从脐血分离单个核细胞后,分别培养DC、CIK,DC培养至第5天加入纯化的gp96-肽复合物,继续培养72h,促进DC成熟。于培养第10天将DC、CIK以1:5的比例混合培养,继续培养2-3天后采用LDH法检测对结肠癌CSC的杀伤活性。【结果】1.利用Hoechst33342荧光染料检测HT29细胞中SP细胞的含量为3.45%±0.05%,此外,流式细胞仪分析常规培养的HT29中CD133+细胞的比例为45.38%±10.65%;Western blotting结果显示,HT29贴壁细胞ALDH1蛋白表达阳性。采用3种方法检测常规培养的HT29贴壁细胞,均表明其存在肿瘤干细胞亚群。2.无血清悬浮培养7-10d,可形成规则的HT29微球,且状态最佳;血清可以促进HT29微球的分化;此外,HT29微球可在含血清培养基(SSM)和无血清培养基(SFM)中交替转化。3.HT29结肠癌干细胞富集效果的检测显示:HT29微球中CD133+细胞的比例高于常规培养的HT29细胞中CD133+的细胞比例(P0.05),HT29微球中ALDH1蛋白表达量与常规培养的HT29细胞相比明显提高(P0.05),HT29微球的克隆形成率较HT29细胞明显升高,差异有统计学意义(P0.01)。4.经SDS-PAGE、蛋白免疫印迹鉴定从HT29微球中提取、纯化出的蛋白为gp96-肽复合物。1g湿重的HT29微球经纯化后可得到纯度95%的gp96-肽复合物40μg左右。5.负载gp96-肽复合物的DC与CIK共培养后,当效靶比为40:1时,对HT29结肠癌CSC的杀伤效果明显,杀伤率[(33.07±2.79)%]要高于DC+CIK组[(15.20±1.67)%](P0.05)。【结论】1.悬浮培养法可用于富集HT29结肠癌干细胞,且便于操作,适于实验研究。2.通过硫酸铵盐析、Con A亲和层析、DEAE离子交换层析从HT29微球中成功纯化出gp96-肽复合物。3.负载gp96-肽复合物的DC-CIK可以有效地杀伤结肠癌干细胞,为肿瘤干细胞新策略的研究奠定了实验基础。
【关键词】：结肠癌 肿瘤干细胞 富集 悬浮培养 热休克蛋白96 纯化 树突细胞 杀伤细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 缩略语/符号说明11-13
• 前言13-15
• 研究现状、成果13-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、悬浮培养法富集结肠癌CSC15-38
• 1.1 对象和方法15-25
• 1.1.1 材料15-16
• 1.1.2 主要溶液配制16-19
• 1.1.3 实验方法19-25
• 1.1.4 统计学分析25
• 1.2 结果25-35
• 1.2.1 常规培养的HT29结肠癌细胞中CSC检测25-27
• 1.2.2 悬浮培养法富集结肠癌CSC27-33
• 1.2.3 HT29结肠癌CSC富集效果的检测33-35
• 1.3 讨论35-36
• 1.3.1 分选、富集肿瘤干细胞技术的选择35-36
• 1.3.2 无血清悬浮培养法富集HT29结肠癌CSC实验总结36
• 1.4 小结36-38
• 二、负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源CSC杀伤作用的初步研究38-62
• 2.1 对象和方法38-54
• 2.1.1 材料38-39
• 2.1.2 主要溶液配制39-44
• 2.1.3 实验方法44-53
• 2.1.4 统计学分析53-54
• 2.2 结果54-59
• 2.2.1 HT29微球gp96-肽复合物的提取、纯化及鉴定结果54-56
• 2.2.2 gp96肽复合物诱导DC-CIK杀伤HT29结肠癌CSC实验结果56-59
• 2.3 讨论59-61
• 2.3.1 gp96肽复合物的提取与纯化59-61
• 2.3.2 负载结肠癌干细胞gp96-肽复合物DC-CIK对同源CSC杀伤效果的实验总结61
• 2.4 小结61-62
• 结论62-63
• 参考文献63-67
• 发表论文和参加科研情况说明67-68
• 综述68-80
• 综述参考文献75-80
• 致谢80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈才伟;贾晓娟;孟颂东;刘文军;;Gp96蛋白的免疫学及其临床应用研究进展[J];生物工程学报;2011年05期

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本文编号：993019