下调Wnt4基因后对胸腺瘤细胞凋亡的影响

发布时间：2017-10-08 09:07

  本文关键词：下调Wnt4基因后对胸腺瘤细胞凋亡的影响

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【摘要】：目的:通过构建shRNA干扰下调人胸腺瘤细胞中Wnt4基因的表达,研究Wnt4基因对胸腺瘤细胞凋亡情况的影响。同时初步探索人胸腺瘤细胞中Wnt4基因发挥作用可能依赖的信号传导通路。方法:1.根据shRNA设计的相关标准,构建针对Wnt4基因的4个干扰位点,合成相应的序列片段,构建shRNA-Wnt4干扰质粒。经鉴定片段成功插入后,用LipofectamineTM2000作为媒介分别转染重组的四种干扰质粒和空白质粒到体外培养的人胸腺瘤细胞。采用RT-PCR检测转染后Wnt4 mRNA表达,并在四个重组质粒中挑选出对Wnt4基因抑制效果最好的干扰质粒进行后续实验。2.将体外培养的人胸腺瘤细胞分成4组:空白对照组;lipo2000组;转染TR001质粒组;转染干扰质粒组。用LipofectamineTM2000进行转染48H,采用Wright’s-Giemsa’s混合染色、Hoechst-33342/PI荧光双染色、流式细胞学分析、Western blot等方法检测人胸腺瘤细胞的凋亡。3.将体外培养的人胸腺瘤细胞分成3组:目的质粒组、空质粒(TR001)组、空白对照组;各组细胞按照分组处理后以LipofectamineTM2000转染不同质粒,采用RT-PCR及Western blot检测细胞Wnt4、JNK、β-catenin的mRNA及蛋白表达。结果:1.与相应对照组比较,四种shRNA-Wnt4干扰质粒中shRNA-Wnt4-3抑制率为52.37%(P0.05)。作为抑制效果最佳的重组质粒进入下一步实验。2.与相应对照组比较,经过shRNA-Wnt4-3质粒干扰后的人胸腺瘤细胞的细胞凋亡率明显升高(14.70±0.62、p0.001),差异有统计学意义。3.Wnt4基因下调后人胸腺瘤细胞内JNK基因表达也显著下调(P0.01),且两者变化趋势一致。结论:1、shRNA-Wnt4-3质粒能够有效地抑制人胸腺瘤细胞中Wnt4基因的表达。2、通过干扰人胸腺瘤细胞中的Wnt4基因能够促进人胸腺瘤细胞的凋亡。提示Wnt4基因的异常表达可是部分人胸腺瘤发生和发展的机制之一。3、采用shRNA干扰Wnt4基因后体外培养的人胸腺瘤细胞内JNK基因表达显著下调,说明Wnt4基因与JNK基因的表达有一定的相关性,Wnt4基因可能依赖于非经典的Wnt/JNK信号通路发挥作用。
【关键词】：Wnt4基因 JNK基因 胸腺瘤 细胞凋亡 Wright’s-Giemsa’s混合染色 Hoechst-33342/PI荧光双染色 蛋白免疫印迹技术 流式细胞技术
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R736.3
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-14
• 研究现状、成果12-13
• 研究目的、方法13-14
• 一、Wnt4-shRNA干扰质粒的构建及筛选14-29
• 1.1 研究对象和方法14-24
• 1.1.1 细胞系来源与干扰质粒构建14-16
• 1.1.2 干扰质粒的筛选16-24
• 1.1.3 统计学分析24
• 1.2 结果24-26
• 1.2.1 psi-H1-shRNA-Wnt4干扰质粒的鉴定24-25
• 1.2.2 psi-H1-shRNA-Wnt4干扰质粒对Wnt4基因的抑制作用25-26
• 1.3 讨论26-28
• 1.4 小结28-29
• 二、干扰Wnt4基因后对人胸腺瘤细胞凋亡情况的影响29-51
• 2.1 研究对象和方法29-42
• 2.1.1 研究对象29
• 2.1.2 主要实验用品29-33
• 2.1.3 细胞培养与实验分组33
• 2.1.4 质粒转染33-34
• 2.1.5 Wright’s-Giemsa’s混合染色34-35
• 2.1.6 Hoechst-33342/PI荧光双染色35
• 2.1.7 流式细胞学分析细胞凋亡情况35-36
• 2.1.8 Western blot检测Caspase-3 及裂解片段36-42
• 2.1.9 统计学分析42
• 2.2 结果42-48
• 2.2.1 Wright’s-Giemsa’s混合染色结果42-44
• 2.2.2 Hoechst-33342/PI荧光双染色结果44-47
• 2.2.3 流式细胞学分析结果47-48
• 2.2.4 Western blot检测Caspase-3 及裂解片段结果48
• 2.3 讨论48-50
• 2.4 小结50-51
• 三、shRNA-Wnt4质粒干扰人胸腺瘤细胞后对JNK、β-catenin基因的影响51-60
• 3.1 研究对象和方法51-55
• 3.1.1 研究对象51
• 3.1.2 主要实验用品51-53
• 3.1.3 细胞培养与实验分组53
• 3.1.4 质粒转染53
• 3.1.5 PCR检测Wnt4、β-catenin、JNK在各组中的表达水平53-54
• 3.1.6 Western blot检测Wnt4蛋白、JNK蛋白表达54-55
• 3.1.7 统计学分析55
• 3.2 结果55-58
• 3.2.1 β-catenin、JNK普通PCR产物凝胶电泳图55-56
• 3.2.2 β-catenin、JNK普通PCR产物测序56
• 3.2.3 shRNA干扰Wnt4基因后对JNK基因表达的影响56-57
• 3.2.4 shRNA对人胸腺瘤细胞Wnt4蛋白表达的影响57-58
• 3.2.5 shRNA干扰Wnt4基因后对JNK蛋白表达的影响58
• 3.3 讨论58-59
• 3.4 小结59-60
• 结论60-61
• 参考文献61-65
• 发表论文和参加科研情况说明65-66
• 综述《细胞凋亡检测方法研究进展》66-77
• 综述参考文献73-77
• 致谢77

【共引文献】

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10 阳声芝;二烯丙基二硫作用于人白血病K562细胞后凋亡相关基因的差异表达[D];南华大学;2013年

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本文编号：993152