桔梗皂苷-D对NSCLC细胞H460和A549的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-08 11:44

  本文关键词：桔梗皂苷-D对NSCLC细胞H460和A549的作用及其机制研究

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【摘要】：目的：非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80%-85%,其恶性程度较高,5年生存率不到15%。并且,约80-90%的NSCLC患者最终死于肺癌的转移。因此,更有效的抗NSCLC药物亟需被开发,从而提高患者生存率。近年来,60%的抗癌新药直接或间接来自于天然药物,尤其是中药中提取的单体在癌症的治疗和预防中起到重要作用。中药桔梗被广泛地用于中医临床治疗各种肺部和呼吸系统疾病。桔梗皂苷-D(Platycodin-D, PD)是从中药桔梗中提取的一种三萜类单体,是桔梗抗癌作用的主要有效成分。前期实验通过高通量筛选发现PD对NSCLC中的H460和A549细胞株均具有有效的体外抑制作用。本论文旨在从阻滞细胞生长周期、诱导细胞凋亡、自噬和抑制细胞转移四个方面探究PD对NSCLC细胞H460和A549的作用机制,为PD的进一步药物研发和临床应用提供实验基础和依据。方法：采用MTT法检测细胞的增殖抑制率；Hoechst-33258荧光染色观察细胞核形态的变化；透射电镜(TEM)观察细胞超微形态结构的改变；流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布和早期凋；Annexin-V/PI/Hoechst-33258染色结合高内涵(HCS)分析细胞凋亡；实时定量PCR (RT-PCR)检测细胞中LC3-Ⅱ、MMP-2和MMP-9 mRNA的水平；细胞粘附实验、划痕实验、Transwell小室侵袭实验分别检测细胞粘附、迁移和侵袭能力；Western-blot蛋白印迹法分析细胞周期、线粒体凋亡通路、MAPK信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白及MMP-2和MMP-9蛋白表达水平的变化。结果：1.MTT检测结果显示,PD有效抑制H460和A549细胞存活率和增殖,并均呈剂量和时间依赖性。FCM检测结果表明,与空白对照组相比,PD作用H460细胞后,G2／M和S期细胞分布数量显著增加(P0.05)；PD作用A549细胞后,GO／G1期细胞分布数量显著增加(P0.05)。 Western-blot进一步检测PD作用后细胞周期相关蛋白的变化。结果发现,H460细胞中G2／M和S期相关蛋白Cyclin-E2、CDK2、Cyclin-B1和p-Cdc2的表达下调,并且细胞周期抑制蛋白P27的表达上调；而在A549细胞中GO／G1期相关蛋白Cyclin-D1, Cyclin-D3, CDK4和CDK6的表达下调,并且细胞周期抑制蛋白P18的表达上调。同时,PD抑制细胞周期下游调控蛋白E2F1和p-Rb(Ser807和Ser795)表达。2. Hoechst-33258荧光染色发现,PD作用后的H460和A549细胞都出现细胞核凋亡形态的改变：细胞核缩小,核染色质碎裂,形成多个微核,并且,随着PD浓度的增加,细胞核凋亡形态越明显。FCM检测发现,PD增加了两种细胞凋亡率,并呈浓度依赖性(P0.05或P0.01)。高内涵分析发现,随着PD浓度的增加,H460和A549细胞中Annexin.V ／PI/Hoechest.33258的平均荧光密度增加(P0.05),表明PD诱导两种凋亡并呈浓度依赖性。Western-blot进一步检测发现,PD通过上调Bax.Bim.Caspase-9.cleaved-Caspase-3和PARP的表达,下调Bcl-2和Caspase-3的表达诱导H460和A549细胞线粒体途径凋亡；同时,PD抑制Erk信号通路中Ras.p-c-Raf和p-Erk蛋白的表达,并且PD诱导H460和A549细胞凋亡可能与此作用有关。3.TCM观察发现,PD作用H460和A549细胞后,细胞中出现双层膜结构的自噬小体。Western-blot检测发现,PD通过增加细胞内LC3-I向LC3-II的转化水平和Atg-3.Atg-7. Beclin-1表达水平诱导H460和A549细胞自噬。RT-PCR检测自噬金指标LC3-II在mRNA水平变化,发现PD上调了两种细胞中LC3-Ⅱ mRNA的表达(P0.05)。进一步检测PD对P13K/Akt/mTOR信号通路作用,发现两种细胞中p-Akt(Ser473).p-p70S6K(Thr37/46)和p-4EBP1(Thr37/46)的表达被抑制。并且,通过使用胰岛素(P13K/Akt/mTOR信号通路激活剂)、LY294002(P13K抑制剂)和雷帕霉素(mTOR抑制剂)进一步证明,PD诱导H460和A549细胞自噬与抑制P13K/Akt/mTOR信号通路有关。同时,检测PD对MAPK信号通路的作用,发现两种细胞内p-p38 MAPK和p-JNK的表达水平增高,然而,p-Erkl/2的表达被抑制。并通过使用U0126(Erk1/2抑制剂)、SP60012(JNK抑制剂)和SB203580(p38 MAPK抑制剂)进一步证明了PD诱导H460和A549细胞自噬和激活p-p38MAPK和JNK表达有关,而与抑制Erkl/2无关。4.PD有效抑制H460和A549细胞粘附、侵袭和迁移能力,并呈浓度依赖性(P0.05)。PD降低H460和A549细胞中MMP-2和MMP-9 mRNA的表达(P0.01)；同时,PD下调H460和A549细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达,并抑制其上游Ras、p-c-Raf、p-Erk1/2和p-Akt的表达,并呈浓度和时间依赖性。结论：1.PD有效抑制H460和A549细胞增殖和细胞活性。并且,PD引发H460细胞S和G2/M期周期阻滞和A549细胞G0/G1期周期阻滞。2.PD通过线粒体凋亡途径诱导H460和A549细胞凋亡诱导,并且此凋亡诱导作用可能与抑制Erk信号通路有关。3.PD通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路和激活JNK和p38 MAPK信号通路诱导H460和A549细胞自噬。4.PD抑制H460和A549细胞粘附、侵袭和迁移,并且此作用与下调MMP-2和MMP-9 mRNA和蛋白的表达、抑制其上游Erk信号通路和p-Akt表达有关。
【关键词】：桔梗皂苷-D 细胞周期 凋亡 自噬 转移 PI3K/Akt/mTOR信号通路 MAPK信号通路
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 理论研究16-21
• 第一章 桔梗皂苷-D抗NSCLC的理论基础16-18
• 1. 中医对肺癌的认识16
• 2. 中药桔梗与肺癌治疗16-17
• 3. 桔梗皂苷-D与肺癌治疗17-18
• 第二章 抗肿瘤药物主要作用机理18-21
• 1. 阻滞肿瘤细胞周期18
• 2. 诱导肿瘤细胞程序性死亡18-20
• 3. 抑制肿瘤转移20-21
• 第二部分 实验研究21-57
• 第一章 PD对NSCLC细胞H460和A549体外增殖抑制和细胞周期阻滞作用初探21-29
• 1. 材料和方法21-22
• 2. 实验方法22-23
• 3. 结果23-27
• 4. 讨论27-29
• 第二章 PD诱导H460和A549细胞凋亡及其机制研究29-39
• 1. 材料和方法29
• 2. 实验方法29-30
• 3. 结果30-37
• 4. 讨论37-39
• 第三章 PD诱导H460和A549细胞自噬及其机制研究39-49
• 1. 材料和方法39
• 2. 实验方法39-40
• 3. 结果40-47
• 4. 讨论47-49
• 第四章 PD抑制H460和A549细胞粘附、侵袭和迁移的作用机制研究49-57
• 1. 材料和方法49
• 2. 实验方法49-50
• 3. 结果50-56
• 4. 讨论56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-64
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果64-65
• 致谢65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

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本文编号：993847