益气活血解毒方调控Tregs相关SNPs位点治疗气虚血瘀型晚期卵巢癌的研究

发布时间：2018-01-18 09:28

本文关键词：益气活血解毒方调控Tregs相关SNPs位点治疗气虚血瘀型晚期卵巢癌的研究　出处：《中国中医科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：由于卵巢癌的早期症状不明显且缺乏特异性,其早期诊断的技术也一直未见提高,患者发现时一般已处于晚期阶段,虽然对其治疗方法一直在探索,其标准治疗手术加化疗的方案也一直在精进,但其效果差强人意,尚未取得令人满意的疗效,而且该病发病后容易复发,故卵巢癌一直是女性健康的一大杀手。临床数据显示约70%的卵巢癌患者在发现时已为晚期,但是目前,行最大程度的满意的肿瘤细胞减灭术联合铂类与紫杉醇类药物的一线化疗方案仍为其标准治疗。近几十年来,随着医学技术的不断进步、发展以及化疗药物的发现和使用,手术和化疗已经有了很大的进步,但据美国流行病学和数据库显示,近三十年来晚期卵巢癌的5年生存率仍未见明显的改善、提高。近年来,中医药对于卵巢癌患者的治疗得到了人们的关注,无论是在延长患者的无进展生存期、提高患者的生活质量、改善放化疗产生的副反应方面都得到了大家的认可。经过前期临床研究我们发现:晚期卵巢癌患者的中医临床证型以气虚证和血瘀证等证为主要证型。故我的导师卢雯平教授针对该类型的患者运用自拟益气活血解毒方进行临床辨证治疗,该方是在近现代名中医张锡纯用以治疗妇科肿瘤名方“理冲汤”的基础之上,结合我科名老中医孙桂芝教授、朴炳奎教授的经验进行加减而成的有效的抗肿瘤验方,主要的药物组成是:黄芪、山药、白术、枸杞子、女贞子、莪术、三棱、青皮、海藻、青蒿、白花蛇舌草、穿山甲、全虫,黄芪补气力量最强,效果最好,为方中益气主要药物,山药、白术健脾气,升清气,培补后天之气,故而能够从根本上调节人体气的生成,同时达到治病必求于本的目的。气为血之帅,血为气之母,补气的同时也要注重补人体之精血,使得气血相和,不致偏颇,故加入枸杞子、女贞子等补血养精之品。莪术、三棱、青皮、海藻、穿山甲、全虫等物具有活血行气、软坚散结之功能,益气的同时注重活血行气。青蒿、白花蛇舌草则以清热解毒为主要功用。综上所述,理冲汤消补兼施,扶正祛瘀,加入虫类药取其久病入络,增加活血通络散结之力,加一些清化之品白花蛇舌草、青蒿取其本病日久易化热化火伤津之意。Tregs细胞是现代肿瘤医学对卵巢癌研究的新视角,现代研究发现肿瘤的病理机制多与免疫系统相关,而Tregs细胞就是免疫系统中与免疫相关的重要一环。免疫治疗被认为是突破现有治疗的最有希望疗法,但肿瘤微环境中复杂的免疫抑制分子机制及缺乏对卵巢癌个体免疫差异的认识,使得其在临床未取得明显进展。最新研究表明,调节T细胞(Tregs)是卵巢癌肿瘤微环境复杂免疫网络中调控免疫逃逸和血管生成的关键免疫抑制因子,其相关基因的多态性(SNPs)与卵巢癌预后密切相关,研究Tregs细胞的发生机制与卵巢癌的关系对临床制定卵巢癌的治疗方案具有积极作用。CD24参与细胞的粘附和转移,被证实是血小板和内皮细胞的粘附受体,导致了肿瘤细胞在血液中的转移,被认为是一种新的致癌因子,也是肿瘤诊断和预后的重要标志,且有相关研究表明CD24与Tregs发挥免疫功能具有相关性。通过临床的前期研究我们发现益气活血解毒方可以调节外周血中Tregs的水平,增强晚期卵巢癌患者机体的免疫力,从而降低其免疫抑制的作用,缓解患者的临床症状,同时有效提高其生活质量。初步实验研究也发现益气活血解毒中药联合DC疫苗对小鼠移植瘤生长有抑制作用,其疗效的发挥与免疫抑制因子TGFβ1和IL-10有关,而这两种细胞因子来源于Tregs。故而我们推测该方延长气虚血瘀型晚期卵巢癌生存可能与调控Tregs相关的免疫有关。拟从Tregs切入,采用SNPs及mRNA芯片技术,用以探究与辨证论治疗效有关的Tregs相关基因的多态(SNPs)特点及该方对对应标志基因表达的影响,方证与疗效相结合,从而探索晚期卵巢癌气虚血瘀证型的基因多态性的特点以及其中药干预机制,为中药个体化治疗提供实验研究依据。目的:1筛选出与益气活血解毒方疗效相关的SNPs位点;2探究益气活血解毒方对差异SNPs对应的基因mRNA表达的影响。方法:本研究共入组300例晚期卵巢癌患者,证候辨证为气虚血瘀型。服益气活血解毒方半年后抽取外周血10～15ml,运用Illumina Human Exome-12v1-1芯片,从300例气虚血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取DNA(TIANGEN TIANamp Blood DNA Kit),对样品的gDNA进行浓度和纯度检测后进行全基因组的扩增、杂交,杂交后,通过清洗去掉非特异性结合的DNA,剩下特异性结合的位点进行单碱基延伸,染色后利用Illuminai Scan Reader进行扫描,将iScan系统扫描得到的原始数据导入Illumina官方软件GenomeStudio Genotyping模块中,利用该模块进行数据分析。运用 GeneChip(?)PrimeView TM Human Gene Expression Array芯片,从气虚血瘀型晚期卵巢癌患者的血液中提取mRNA。观察患者的无进展生存期(PFS),并对其进行癌抗原125(CA125)数值的记录及生活质量的疗后评估,根据患者的中位无进展生存期将患者分为2组,一组为中药有效组,其PFS中位无进展生存,另一组为中药无效组,其PFS≤中位无进展生存。通过有效组和无效组SNPs比较,筛出显著差异的SNPs位点,即可能对中药敏感的SNPs位点,GO分析:将显著差异的SNPs位点定位得到基因利用GO数据库做功能富集,得到显著的GO功能类别,Pathway分析:得到的基因利用KEGG数据库做功能富集,得到差异基因显著富集的生物通路;有效组和无效组mRNA表达的比较,筛选出差异表达的基因,同上,进行GO分析和Pathway分析,得到差异显著的GO功能类别跟生物通路;将SNPs位点定位所得的基因与差异表达基因取交集,发现中药干预的标志基因。结果:1筛选出具有显著性差异的SNPs位点1773个,位于外显子上的SNPs位点共有1033个,非同义突变的SNPs位点有970个;对差异表达基因进行GO富集分析,发现与免疫相关的GO号有:GO:0006955、GO:0045087,其中GO:0006955与机体的免疫应答有关,GO:0045087与先天性的免疫反应有关,富集到GO:0006955上的基因有18个,具体为:FYB,RGS1,SUSD2,FCGRT,IL18RAP,CR2,IFI44L,CD96,C8A,CD 1C,CXCR5,IL16,SEMA4D,PDCD1LG2,HLA-DMA,MICA,PKHD1L1,HLA-DPA1;富集到GO:0045087 上的基因有 24个,具体是 TAB2,FCN1,MAP3K1,GAB1,DTX4,VNN1,CR2,FOXO3,WIPF3,ITPR2,F12,TRAF3,CD 180,EGF,NLRC5,C8A,NLRP4,IFI16,TLR3,FRS2,CD14,CD19,BPIFB3,DEFB132。对变异位点基因KEGG富集分析得到有显著差异的通路14条,主要涉及嗅觉传导,酪氨酸代谢,糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚生物合成,脂肪酸的降解,精氨酸和脯氨酸代谢,β-丙氨酸代谢,莨菪烷类、哌啶、吡啶生物碱生物合成,丙酮酸代谢,长期的压抑,黄酮和黄酮醇的生物合成,苯丙氨酸代谢,PPAR信号通路,碱基切除修复,味觉传导等信号通路。2通过对mRNA差异表达分析,得到显著差异基因158个,其中上调基因58个,下调基因100个,通过上调的差异基因的GO分析发现在生物学功能领域与免疫相关的GO号6个,GO:0002227、GO:0006955、GO:0002842、GO:0002768、GO:0050776、GO:0050777,GO:0002227,它们与粘膜上的先天免疫应答、免疫应答、正向调控T细胞对肿瘤细胞的免疫调节、免疫反应调节细胞表面受体信号通路、免疫反应调节的生物学功能有关;通过下调的差异基因的GO分析发现在生物学功能领域与免疫相关的GO号有10个,GO:0002566,GO:0002684,GO:0002741,GO:0002925,GO:0002309,GO:0002827,GO:0002218,GO:0045087,GO:0045824,GO:0002286,它们与体细胞突变导致的免疫受体多元化、免疫系统的正向调节、免疫反应中细胞因子的分泌调节、循环免疫球蛋白介导的体液免疫反应、免疫应答、辅助T细胞Ⅰ型的免疫反应、先天免疫反应的激活、先天免疫应答、先天免疫反应的负调节、免疫反应中T细胞的激活有关。mRNA差异基因上调Passway富集得到8条相关的通路,主要涉及哮喘,疟疾,造血细胞系,TGF-β信号转导途径,Toll样受体信号转导途径,吞噬体,异体移植排斥,肿瘤的转录失调;下调的相关通路3条,主要涉及ABC转运体,溶酶体,吞噬小体。3根据基因和表达谱的GO分析在免疫相关功能上取交集可知:与益气活血解毒方疗效相关的可能的免疫方面的生物功能是免疫系统的应答,具体的GO号是GO:0006955,基因分型富集到该term上的基因有18个,具体为:FYB,RGS1,SUSD2,FCGRT,IL18RAP,CR2,IFI44L,CD96,C8A,CDIC,CXCR5,IL16,SEMA4D,PDCD1LG2,HLA-DMA,MICA,PKHD1L1,HLA-DPA1,表达谱富集到该 term 上的基因有 CEACAM8,DEFA1,DEFA1,THBS1,CD24。4可能的中药干预疗效差异的标志基因:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。5益气活血解毒方能够改善气虚血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能,产生差异疗效。6益气活血解毒方可以通过对基因以及相关通路的调节调控Tregs细胞,但与SNPs未见明显相关性,可能与DNA去甲基化或miRNA有关。结论:1与益气活血解毒方疗效相关的SNPs位点有1773个,这些位点可能是对中药敏感的SNPs位点。2益气活血解毒方疗效的差异标志基因可能为:CD40、AFF3、EIF2AK3、WNK1、FYB、FBXL13、PLXNC1、BCL11A、IFI16、GNG7。3益气活血解毒方可能通过改善气虚血瘀型晚期卵巢癌患者的免疫功能,产生差异疗效。4益气活血解毒方可能通过对基因以及相关通路的调节调控Tregs细胞治疗气虚血瘀型晚期卵巢癌,但与SNPs位点未见明显相关性,可能与DNA去甲基化或miRNA有关。
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【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R273

【参考文献】