藏药“蒂达”DNA条形码鉴定及中国沙棘生态适宜性研究

发布时间：2018-01-28 01:59

本文关键词： 藏药 “蒂达” 中国沙棘 DNA条形码品种鉴定 GIS Maxent模型生态适宜区　出处：《成都中医药大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来,随着市场需求和自然环境变化的影响,藏药资源遭到破坏。因此,摸清藏药资源分布状况、开展野生资源的保护显得尤为紧迫。另一方面,藏药长期存在的“同名异物”、“同物异名”等多基原现象,导致藏药品种鉴定困难,严重影响了藏药质量控制和评价研究。本文分为两个部分：第一,以复杂多基原藏药“蒂达”((?))为研究对象,重点采用DNA条形码开展其品种鉴定研究；第二,以常用藏药中国沙棘Hippophae rhamnoides L. subsp. sinensis Rousi为研究对象,开展其资源调查、规范化种植、生态适宜区划、化学成分积累与生态因子相关性研究。以期为藏药品种鉴定、野生资源保护和适宜区推广人工栽培种植提供科学依据。目的：建立藏药“蒂达”的DNA条形码鉴定方法；对中国沙棘进行科学的潜在分布预测和适生等级划分；确定影响中国沙棘叶黄酮类成分积累的生态因子及其最佳范围。方法：1.采用试剂盒法对藏药“蒂达”提取总DNA,采用通用引物ITS2(2F/3R)进行PCR扩增,并对扩增成功的PCR产物进行测序。同时对序列进行拼接、比对,计算种内种间K2P距离,构建系统进化NJ树,评价其barcoding gap,从而实现对藏药“蒂达”的DNA条形码分子鉴定；2.从全球气候数据库中提取生态因子,基于Maxent模型设置ROC评价曲线,同时运用ArcGIS软件,对中国沙棘进行适宜区区划研究；3.采用TLC法对中国沙棘叶黄酮类成分进行定性鉴别；采用HPLC法对不同产地中国沙棘叶黄酮类成分进行含量测定；对17批次不同产地中国沙棘叶进行HPLC特征指纹图谱研究,构建准确可靠的中国沙棘叶色谱指纹图谱。4.应用Pearson相关分析、逐步回归分析和偏最小二乘回归法(PLSR),分析不同产地中国沙棘叶化学成分与其生态因子间的相关性。结果：1.ITS2序列可准确鉴定龙胆科藏药“蒂达”类药材：样品共151条序列,比对后序列长度达231 bp；平均GC含量为61.40%,种内变异大,共31个单倍型。其中四数獐牙菜Swertia tetraptera、祁连獐牙菜S. przewalskii、镰萼喉毛花Comastoma falcatum、辐状肋柱花Lomatogonium rotatum各只有1个单倍型。13个“蒂达”物种中,除二叶獐牙菜S. bifolia和华北獐牙菜S. wolfangiana2个种外,11个物种均能准确鉴定。2.课题组建立了产业化治沙科技试验示范基地、红原县藏医院沙棘规范化栽培示范基地和松潘县川主寺贝母基地(沙棘规范化栽培示范基地)等3个沙棘防沙漠化规范化栽培示范基地,共计6亩。基于Maxent模型区划结果表明：中国沙棘在我国分布的适宜指数为0-0.708。适宜区面积大59.05万km~2,占全国总面积的6.13%,分布范围涉及山西、陕西、宁夏、四川、甘肃、青海、四川、西藏、内蒙古、辽宁等10个省(自治区)；较适宜区面积达55.25万km~2,占全国总面积的5.73%,分布范围包括河北、辽宁、内蒙古省(自治区)。3.以槲皮素、山柰素和异鼠李素为对照品建立了中国沙棘叶的薄层色谱鉴别方法；17批次中国沙棘叶HPLC含量测定结果表明：槲皮素含量在0.1929%-0.5236%之间、异鼠李素含量在0.2242%-0.6236%之间、山柰素含量在0.0772%-0.1775%之间。可见,不同产地间中国沙棘叶中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量差异明显；不同批次的中国沙棘叶HPLC指纹图谱研究结果显示,17批次中国沙棘叶共有14个共有峰,与标准品对照,可确定山柰素-3-O-β-D-槐二糖-7-O-a-L-鼠李糖苷、异鼠李素-3-O-p-D-槐二糖-7-O-a-L-鼠李糖苷、异鼠李素-3-0-p-D-葡萄糖-7-O-a-L-鼠李糖苷、芦丁、异鼠李素-3-O-p-D-葡萄糖苷等5个色谱峰。对17批中国沙棘叶的特征指纹图谱进行相似度计算,结果表明17批样品中,相似度均在0.80以上,来自四川省阿坝州红原县、西藏拉萨市达孜县、西藏拉萨市曲水县、陕西省晋中市4批次相似度小于0.9,其余13批次相似度达0.9以上。4.确定了影响中国沙棘叶中槲皮素、山柰素和异鼠李素含量积累的主导生态因子及其最佳范围,在最佳范围内,相应化合物含量最高,具体如下：影响槲皮素积累的主导因子为海拔高度、1月月均降水量和8月月均降水量,其最佳范围分别为3009-3320 m、4.0-6.0mm和118-152mm；影响山柰素含量积累的主导因子为海拔高度、最冷季度降水量、12月月均降水量和3月平均气温,其最佳范围分别为2999-3315 m、9.0-12.0mm、1.0-2.0 mm和-1.9-0.1℃；影响异鼠李素含量积累的主导因子为8月月均降水量、1月月均降水量、最冷季度降水量和海拔高度；其最佳范围分别为：118-122mm、4.0-5.0 mm、13.0-22.0 mm和3158-3568 m。结论：1.DNA条形码能够快速、准确鉴定龙胆科藏药“蒂达”类药材。在鉴定工作中,应综合运用不同鉴定手段,以达到鉴定目的。2.中国沙棘适宜区分布在我国10省(自治区),其适宜区域和较适宜区面积广,资源数量大,适合可持续开发利用。
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【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R29

【参考文献】