“补肾活血舒筋方”对骨髓间充质干细胞迁移及NF-κB、CXCR4表达的影响

发布时间：2018-01-29 18:16

  本文关键词： “补肾活血舒筋方” BMSCs 迁移 NF-κB CXCR4　出处：《南京中医药大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：颈腰痛是骨伤科临床最常见的疾病,据统计80%的人一生中会为此就诊。椎间盘退变(Intervertebral disc degeneration, IVDD)是颈腰痛发病重要的病理因素,但退变的机理目前还不十分明确,有关椎间盘退变的机理及减缓椎间盘退变的方法是当今研究的热点。研究目的由于椎间盘缺乏血管且细胞数量少,其本身几乎不能自我修复。有研究发现,应用骨髓间充质干细胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)治疗,可以促进椎间盘组织的再生。由于BMSCs的来源有限及植入问题,促进内源性BSMDs归巢成为一种新的选择。临床研究发现,应用“补肾活血舒筋方”治疗颈腰痛疗效显著,既往实验证明,“补肾活血舒筋方”可以通过调节核因子(Nuclear factor-κB,NF-κB)抑制炎症反应和椎间盘退变的发展。因此,我们提出假说,“补肾活血舒筋方”通过调节NF-κB/CXCR4促进BMSCs归巢至退变的椎间盘,进而修复退变的椎间盘,达到治疗颈腰痛的目的。本研究通过体外实验观察“补肾活血舒筋方”对大鼠BMSCs增殖、迁移及NF-κB、CXCR4表达的影响,并初步探讨BMSCs迁移的可能机制。研究方法取4周龄SPF级SD大鼠,分离其后肢股骨,采用全骨髓贴壁法分离并提取大鼠BMSCs,放置于含有预热的培养基及10%胎牛血清的T25培养瓶中进行培养,应用倒置显微镜观察细胞形态。取培养纯化至第3代后的BMSCs分别用成脂和成骨培养基定向诱导分化,并用油红O及茜素红染色鉴定分化后的细胞。制备“补肾活血舒筋方”中药原液,取20只成年SD大鼠随机分成四组,高、中、低中药血清组分别灌服高、中、低浓度中药原液,对照组灌服等体积双蒸水,制备高、中、低浓度“补肾活血舒筋方”含药血清及空白血清,采用中药化学指纹图谱对中药原液及含药血清进行质量控制。将高、中、低浓度“补肾活血舒筋方”含药血清及空白血清与生长良好的第3代BMSCs干预培养24h,应用Cell CountingKit-8(CCK-8)法检测各组BMSCs的增殖情况。将高、中、低浓度“补肾活血舒筋方”含药血清及空白血清与生长良好的第3代BMSCs干预培养48h,应用transwell小室观察不同浓度含药血清作用后BMSCs的迁移情况。将高、中、低浓度“补肾活血舒筋方”含药血清及空白血清与生长良好的第3代BMSCs干预培养48h,应用Western Bloting检测NF-κB、CXCR4蛋白的表达。结果1.大鼠BMSCs的形态学观察及鉴定：全骨髓贴壁方法所获得的BMSCs培养5-7日即可传代,传代后增殖速度较原代明显增快,3d左右可融合达80%。第3至第5代细胞纯化程度高,细胞增殖能力强;传代后培养的BMSCs呈纺锤形或多角形,细胞数目多、排列紧密时可呈漩涡状排列。成脂诱导培养基诱导培养BMSCs,每三天可观察到改变,诱导结束后观察到细胞内被油红O染红的脂滴；成骨诱导培养基诱导培养BMSCs,每三天可观察到改变,诱导14天后培养基内可见能够被茜素红染色的钙结节。2、“补肾活血舒筋方”含药血清的制备：液相色谱-质谱联用(LC-MS)仪在中药原液中检测到12种有效成分,其中7种入血,血清样品中以阿魏酸(川芎、当归)、川续断皂苷(续断)、原儿茶酸(狗脊)含量最高,含药血清中者三种有效成分含量具有浓度梯度差。3、“补肾活血舒筋方”对BMSCs增殖及迁移的影响：CCK-8结果显示,各浓度含药血清组细胞生存率与对照组有明显区别,P0.05,但是各浓度含药血清组之间差异不显著,P0.05。将高、中、低浓度“补肾活血舒筋方”含药血清及空白血清与BMSCs干预培养48h后,倒置相差显微镜下观察各组上室下侧均可见细胞,说明BMSCs存在迁移行为。其中,与对照组比较,低浓度含药血清组迁移数目增多,但差异无统计学意义(P0.05)。中、高浓度含药血清组迁移细胞数目明显多于对照组,差异有统计学意义(P0.05),其中高浓度含药血清组迁移细胞数最多。高、中、低浓度含药血清组之间差异有统计学意义(P0.05)。4、“补肾活血舒筋方”对NF-κB、CXCR4蛋白表达的影响：Western bloting结果显示,各实验组κB、CXCR4蛋白均有表达,与对照组比较,高、中、低浓度“补肾活血舒筋方”含药血组κB、CXCR4蛋白表达量增高明显(P0.05),差异有统计学意义。高、中、低浓度含药血清组之间差异有统计学意义(P0.05)。结论“补肾活血舒筋方”可促进大鼠BMSCs NF-κB、CXCR4蛋白的表达。说明“补肾活血舒筋方”可能通过提高NF-κB、CXCR4的表达促进BMSCs的迁移。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R274.9

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本文编号：1474046