从造血干细胞增殖及造血微环境探讨中药治疗β地中海贫血的分子机制

发布时间：2018-03-30 19:46

本文选题：“肾生髓、髓生血”　切入点：地中海贫血　出处：《中国中医科学院》2016年博士论文

【摘要】：β地中海贫血(简称β地贫),属于常染色体隐性遗传血红蛋白病。地贫广泛分布于热带、亚热带。地中海以及东南亚地区(印度、泰国、印度尼西亚)是地贫的高发区,中国地贫高发区主要分布在南方广西、广东。地贫是在世界范围内发病率高、危害大、致死率高的单基因遗传病,重型和中间型地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题。现代医学目前尚未找到根治大量新生地贫患儿的解决方案,如何提高这类人群的生存质量是现代医学亟待解决的问题。地贫发病机制明确,但对其治疗相对滞后。导师吴志奎教授基于“肾生髓、髓生血”理论,用“补肾益髓”法在地贫高发区治疗β地贫取得了肯定疗效。积累了30多年临床实践,首次对地贫的中医理论认识、核心病机、中医药治疗地贫的治则治法和疗效作用的可能机制提出了较明确的认识。创建了系统的理论与有效治法,填补了植物药治疗地贫的临床空白,扩大了中医药治疗单基因遗传病的国际影响。本论文的主要内容是在深入学习传承导师“补肾益髓”治疗地贫理论和临床实践经验,总结前期工作的基础上,首次在高发区开展“补肾益髓”治疗β地贫随机、双盲、安慰剂对照规范临床研究并对其疗效的可能机制提出研究假说,认为“补肾益髓”治疗地贫发挥疗效的可能机制是通过改善造血微环境,调控骨髓造血干细胞增殖分化、影响DNA甲基化表观遗传修饰,进而促进骨髓有效造血实现的。通过分离培养骨髓造血干细胞、间充质干细胞,采用RT-PCR检测珠蛋白基因表达调控,利用Western blot,DNA甲基化芯片,透射电镜等现代生物信息学技术,体内外实验相结合,验证假说的客观性。一、研究目标开展补肾益髓治疗β地贫临床规范研究;并从改善造血微环境,调控骨髓造血干细胞增殖分化,影响DNA甲基化修饰等方面对其促进骨髓有效造血的疗效机制进行深入研究,侧面揭示“肾生髓、髓生血”的理论内涵。本项课题围绕着研究目标从临床和实验两个部分展开研究。1补肾益髓治疗地贫的临床研究1.1地贫患者中医证候分布规律调查调查中医肾虚证候(肾精亏虚证、肾阴虚证、肾阳虚证)在地贫患者中的具体分布,中医肾虚症候积分与基因型的关系以及在地贫患者中的差异,为益髓生血颗粒临床辨证治疗地贫提供依据。1.2益髓生血颗粒治疗β地贫临床规范研究采用随机对照试验(随机双盲安慰剂平行对照),临床试验前在国际临床研究注册网站进行注册。对治疗前后患者的中医症候量化评分,连续观察血液指标动态变化,以国际公认的诊断与疗效标准,采用第三方统计分析对治疗结果进行评价。2补肾益髓治疗地贫的机制研究主要围绕着益髓生血颗粒治疗地贫改善骨髓造血微环境,调控骨髓造血干细胞增殖分化以及影响DNA甲基化表观遗传修饰,进而促进骨髓有效造血展开。2.1地贫患者内源性骨髓造血干细胞增殖通过观察患者内源性骨髓造血干细胞增殖,益髓生血颗粒含药血清及组分单体对造血干细胞集落分化、珠蛋白基因表达及蛋白含量的影响,探讨“补肾益髓”治疗地贫调控造血干细胞增殖分化的机制。同时对益髓生血颗粒治疗两对双胞胎地贫患儿进行个体研究,观察遗传背景与临床疗效、骨髓造血干细胞增殖的关系。2.2益髓生血颗粒改善骨髓造血微环境调控骨髓有效造血通过检测益髓生血颗粒治疗地贫对骨髓血血浆细胞因子活性,红细胞免疫酶活性,以及对间充质干细胞增殖、分泌细胞因子活性与基因表达,观察补肾益髓治疗地贫对造血微环境调控的影响。2.3益髓生血颗粒治疗地贫对DNA甲基化修饰的影响通过对益髓生血颗治疗β地贫有效病例进行全基因组DNA甲基化分析,探讨益髓生血颗粒治疗地贫对DNA甲基化表观遗传修饰的影响,从表观遗传修饰方向寻找与造血相关的功能基因。二、研究方法及结果1 临床研究方法及结果1.1地贫患者中医证候分布规律调查采集地贫患者临床基础数据,制定地贫流行病学调查表。调查299例地贫患者(肾虚证)基因型,对中医证候进行分类(肾精亏虚证、肾阴虚证、肾阳虚证),对26项中医症候进行评分汇总。对不同基因型地贫的中医证候,症候积分进行统计分析,观察中医证候在地贫患者中的分布。地贫患者中医证候调查结果显示,在调查的所有患者中,以肾阴虚证195例最为多见,其次为肾精亏虚证89例,肾阳虚证所占比例较少。涉及的26项中医肾虚症侯出现的频率以面色萎黄、盗汗、口唇淡白、神疲乏力、咽干、口干多见,地贫患者阴血亏虚见面色萎黄、口唇淡白；血虚则气弱,神疲乏力；阴虚则见盗汗、口干、咽干。β地贫患者基因型为纯合子或杂合子的肾虚症候积分无统计学差异。1.2益髓生血颗粒治疗β地贫高发区临床规范研究采用随机、双盲、安慰剂平行对照方法,试验前在国际临床研究网站进行注册(https://clinicaltrials.gov/,NCT01549080),对患者中医症候量化评分,动态观察临床血液指标变化,由第三方编盲与第三方统计,以国际公认的诊断与疗效标准,对临床治疗结果进行评价。入组40例β地贫患者,随机分为实验组和对照组,实验组给予益髓生血颗粒,对照组给予安慰剂,疗程12周。治疗前和治疗第4周、8周、12周分别对患者外周血Hb.RBC、Ret、HbF、WBC、PLT进行检测,以Hb上升≥5g/L为临床治疗有效病例。益髓生血颗粒治疗β地贫结果显示,治疗第4周、8周、12周实验组有效率分别为47.06%,47.06%和58.82%；对照组有效率分别为11.11%,5.56%,5.56%；两组有效率比较,三个时间点实验组与对照组有效率比较均有显著的统计差异(4周p0.05,8周p0.01,12周p0.01)。该研究在国内外β地贫临床研究中为首次完成。组内自身比较,实验组治疗第4周,Hb和RBC上升,与疗前比较差异有统计意义(p0.01)；治疗第8周HbF上升,与疗前比较上升有统计学意义(p0.01)；对照组Hb上升没有统计意义。治疗12周,实验组Hb平均水平71.35g/L,高于对照组平均水平68.50g/L,组间各指标比较差异没有统计意义。益髓生血颗粒能够提高患者Hb、RBC、HbF的含量,对患者WBC和PLT的作用效果不明显。2实验研究方法及结果2.1益髓生血颗粒治疗地贫对患者骨髓造血干细胞增殖的影响选取经益髓生血颗粒治疗的5例地贫患者,其中有2对双胞胎患儿(同卵双生β地贫患儿,异卵双生α地贫患儿),疗程12周。治疗前后取患者骨髓血,经淋巴细胞分离液密度梯度离心分离有核细胞,采用磁性分选器经免疫磁珠阳性分选获得骨髓CD34+细胞,对治疗前后骨髓CD34+细胞进行体外连续培养,采用CCK8法检测细胞第2、4、6、7日各时间点的OD值,对两对双胞胎地贫患儿的遗传背景与疗效,与骨髓CD34+细胞的增殖能力进行初步分析。(1)研究显示,5例患者疗后骨髓CD34+细胞体外培养自第2日开始,增殖较快,至第7日疗后CD34+细胞增殖OD值为0.62,较疗前骨髓CD34+细胞增殖明显提高(p0.01)。提示益髓生血颗粒治疗地贫可显著促进患者内源性骨髓CD34+细胞增殖。(2)研究还对不同类型(α型,β型)的两对双胞胎地贫患儿,进行了遗传背景与临床疗效、骨髓CD34+细胞的增殖能力关系的比较分析。1)结果发现,同卵双生β地贫患儿(基因型p41-42/β8)与异卵双生α地贫患儿(基因型--SEA/αCSα,--SEA/α4.2α),遗传背景不同其临床疗效及骨髓CD34+细胞的增殖能力有明显差异。α型地贫双胞胎患儿较β型地贫双胞胎患儿临床贫血症状轻,经益髓生血颗粒治疗后,疗效优于β地贫双胞胎患儿；α地贫双胞胎患儿骨髓CD34+细胞的增殖能力高于β型地贫双胞胎患儿。2)β地贫遗传背景完全相同(基因型β 41-42/β-28),骨髓CD34+细胞体外增殖情况个体差异较大,在临床贫血较轻的患者,其骨髓CD34+细胞的增殖能力较强。α地贫患儿疗后骨髓CD34+细胞增殖能力随时间变化提高明显,基因型--SEA/αCSα(缺失、突变)患儿骨髓CD34+细胞增殖能力较基因型--SEA/α42α(缺失型)患儿更为明显。上述研究结果在中药治疗地贫研究中为首次完成。2.2益髓生血颗粒含药血清诱导红系分化研究研究通过半固体集落培养方法,观察益髓生血颗粒含药血清高、中、低各浓度对骨髓CD34+细胞分化集落的影响；同时以K562细胞为研究对象,用益髓生血颗粒含药血清培养K562细胞,采用联苯胺染色和RT-PCR技术观察益髓生血颗粒诱导K562细胞向红系分化的作用。结果显示益髓生血颗粒含药血清作用第13天,BFU-E集落数量与对照组比较,高剂量组呈现明显的促进集落分化的作用(p0.001)；低剂量组与中剂量组集落数高于对照组,但差异无统计意义(p0.05)。益髓生血颗粒高剂量含药血清能够促进K562细胞a和γ珠蛋白基因表达(p0.05)。2.3益髓生血颗粒君药单体对骨髓造血干细胞分化集落形成的影响研究以君药制首乌组分二苯乙烯苷和大黄素作用骨髓CD34+细胞,观察细胞集落分化形成,采用RT-PCR和Western blot技术检测造血干细胞早期分化集落细胞各珠蛋白(α、β、γ、ε)的基因表达和蛋白含量。研究结果显示,大黄素9.25μM浓度组CFU-E集落数为33.67,3.70μM浓度CFU-E集落数为25.00,与对照组17.00比较差异均有统计意义(p0.05)。取培养第13天集落细胞,珠蛋白基因表达结果显示大黄素9.25μM组能够促进早期分化集落细胞中γ珠蛋白基因表达(p0.05),Western blot结果表明大黄素能够提高骨髓CD34+细胞分化集落细胞β和γ珠蛋白含量。2.4益髓生血颗粒治疗地贫患者对骨髓血中细胞因子活性的影响取益髓生血颗粒治疗患者前后骨髓血,密度梯度离心收集骨髓血血浆、红细胞,采用酶联免疫、透射电镜等实验技术检测益髓生血颗粒对骨髓血内造血细胞因子以及免疫相关酶活性的影响。研究结果显示,益髓生血颗粒治疗12周,骨髓血中细胞因子SCF、G-CSF、 IL-6、EPO含量呈上升的趋势；骨髓血红细胞氧化相关酶活性检测,SOD和GSH-PX表现上升,MDA表现下降,治疗后的外周血红细胞内包涵体数量明显降低,结果提示：益髓生血颗粒可提高地贫患者骨髓中造血相关细胞因子活性,提高抗氧化能力,减少红细胞内包涵体,改善造血微环境,促进有效造血。2.5益髓生血颗粒对骨髓间充质干细胞增殖的影响研究取患者骨髓血,密度梯度离心获得有核细胞,采用免疫磁珠阳性分选方法获得骨髓CD34+细胞,同时将剩余细胞进行连续贴壁培养,获得骨髓间充质干细胞。采用CCK8检测大黄素和二苯乙烯苷对患者骨髓间充质干细胞增殖影响。研究结果显示,单体大黄素一定浓度能够促进骨髓间充质干细胞增殖,二苯乙烯苷一定浓度表现出促进增殖的作用趋势。2.6益髓生血颗粒对骨髓间充质干细胞分泌细胞因子活性与表达的影响连续贴壁培养获得地贫患者骨髓间充质干细胞,采用ELISA和RT-PCR实验技术检测君药单体对患者骨髓间充质干细胞自身分泌细胞因子SCF和IL-6活性和基因表达的影响。研究结果显示,大黄素和二苯乙烯苷能够提高细胞因子SCF活性,对IL-6活性影响不大；大黄素作用骨髓间充质干细胞第八天,能够促进SCF的基因表达(p0.05),二苯乙烯苷对细胞因子SCF和IL-6基因表达没有影响。2.7益髓生血颗粒治疗地贫患者对全基因组DNA甲基化的影响收集5例益髓生血颗粒治疗有效的β地贫病例的外周血有核细胞,采用DNA甲基化芯片技术,对治疗前后的5例β地贫患者进行全基因组DNA甲基化测定。全基因组DNA甲基化研究结果显示,位于11号染色体上的LGR4和PP11159H22.2基因,位于16号染色体上的CCDC101、NUPR1和RP1166602.1基因在治疗后处于低甲基化功能,这些基因的作用与蛋白编码有关。两个关键基因JAK3和MAPK10,存在于骨髓和淋巴系统,JAK3在早期造血过程中与造血细胞因子密切相关。三、研究结论本课题首先对地贫进行了中医肾虚证候分布调查,在中医证候调查的基础上,首次开展益髓生血颗粒治疗β地贫的随机、双盲、安慰剂对照临床试验,进行临床研究国际注册,以规范的临床试验研究验证了益髓生血颗粒治疗地贫的有效性；在临床疗效的基础上,从骨髓造血干细胞增殖分化,骨髓造血微环境调控有效造血及DNA甲基化表观遗传层面对疗效产生的分子机制进行了深入探讨,得出以下结论：1临床研究1.1α地贫和β地贫临床均存在肾虚表现,以肾阴虚证最为多见,基本证型为肾精血不足、肾阴虚证。1.2随机、双盲、安慰剂平行对照评价益髓生血颗粒治疗地贫疗效,疗程结束,实验组地贫患者治疗4周、8周、12周有效率分别为47.06%,47.06%和58.82%；对照组有效率分别为11.11%,5.56%,5.56%;两组各时间节点有效率差异有统计学意义(第4周p0.05,第8周p0.01,第12周p0.01)。该研究在国内外β地贫临床研究中为首次完成。2疗效机制研究2.1益髓生血颗粒能够促进骨髓CD34+细胞增殖分化,促进骨髓有效造血：(1)益髓生血颗粒能够促进地贫患者内源性骨髓CD34+细胞体外增殖。地贫患者骨髓CD34+细胞的增殖具有时间依赖性,随着作用时间的延长,疗后骨髓CD34+细胞增殖能力显著提高。(2)遗传背景与临床疗效、骨髓CD34+细胞的增殖能力关系的比较,遗传背景不同的两对双胞胎地贫患儿,其临床疗效及骨髓CD34+细胞的增殖能力有明显差异；同类型双胞胎患儿,同卵双生β地贫患儿(基因型p41-42/β-28)疗效有个体差异,对异卵双生a地贫患儿(基因型--SEA/acsa,--SEA/α4.2α)基因型不相同疗效也有明显差异。(3)益髓生血颗粒含药血清高剂量组促进骨髓CD34+细胞分化红系集落形成,并能诱导K562细胞向红系分化。(4)益髓生血颗粒组分大黄素能够促进骨髓CD34+细胞分化集落细胞γ珠蛋白基因表达。2.2益髓生血颗粒能够改善骨髓造血微环境,促进骨髓有效造血：(1)益髓生血颗粒能够提高患者骨髓血血浆SCF、IL-6、G-CSF、EPO造血细胞因子含量,提高患者骨髓内红细胞SOD,GSH-PX酶活性。(2)组分单体大黄素能够促进骨髓MSC细胞增殖。(3)大黄素能够提高骨髓MSC细胞分泌细胞因子SCF的活性。(4)益髓生血颗粒治疗β地贫有效病例全基因组DNA甲基化结果显示,两个关键基因JAK3和MAPK 10可能在细胞因子诱导干细胞分化过程中起作用。益髓生血颗粒能够改善骨髓造血微环境,调控骨髓造血干细胞有效造血,表现为能够促进骨髓MSC细胞自分泌细胞因子,减少早期红系集落细胞氧化损伤,促进骨髓造血干细胞增殖,促进造血干细胞早期分化集落细胞Y珠蛋白的基因表达,促进有效造血。益髓生血颗粒缓解地贫患者临床贫血症状的作用机制可能是促进骨髓有效造血,减少骨髓内早期红细胞的溶血。研究结果提示,“肾生髓、髓生血”理论的现代生物学内涵可部分体现为骨髓微环境调控下的骨髓造血干细胞的增殖分化功能。四、论文创新之处1.本研究首次在高发区完成益髓生血颗粒治疗β地贫的随机、双盲、安慰剂平行对照临床试验,进行临床研究国际注册,第三方编盲统计,以国际公认的诊断与疗效标准,对益髓生血颗粒治疗地贫进行疗效评价,在国内外β地贫临床研究中属于首次完成。2.研究发现益髓生血颗粒能够促进地贫患者内源性骨髓CD34+细胞体外增殖。对双胞胎患儿研究发现,遗传背景与疗效、患儿骨髓CD34+细胞增殖密切相关,上述研究在中药治疗地贫疗效机制研究中为首次完成。3.理论创新：论文基于补肾益髓治疗β地贫的明显疗效,从促进患者内源性造血干细胞增殖分化,改善造血微环境,诱导红系分化及影响DNA甲基化表观遗传修饰层面,探讨了补肾益髓治疗β地贫疗效的分子机制,从一个侧面阐释了“肾生髓、髓生血”理论的科学内涵。研究结果为难治疾病防治的现代研究提供了新思路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

【参考文献】