冠心病血瘀证病因病势对心肌细胞能量代谢及病证网络模型的影响
发布时间：2018-04-01 11:26
本文选题：冠心病 切入点：血瘀证 出处：《湖南中医药大学》2016年博士论文
【摘要】：目的研究冠心病急性、慢性血瘀证及不同致瘀因素冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢的变化,探讨不同发病趋势、不同致瘀因素对基于Flux Explorer构建的冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢网络模型的影响。方法(1)理论研究:通过对心肌能量代谢相关文献进行研究,从理论上探讨正常心肌能量代谢的特点、调节及缺血心肌能量代谢的变化,通过对与冠心病相关的中医古籍文献及现代文献的研究,探讨冠心病血瘀证形成的病因病机;通过对生物代谢网络模拟研究、心血管病网络模型研究及中医证候网络模型研究的现状分析,探讨代谢网络模型研究的特点及其优势,为将系统生物学引入中医证候本质的研究,探讨急性、慢性发病趋势及瘀阻、痰扰、寒凝、气滞不同致瘀因素对冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢网络模型的影响提供理论依据。(2)不同发病趋势对心肌细胞能量代谢及网络模型的影响:(1)通过高脂饲养+维生素D3腹腔注射结合冠脉结扎法、ISO反复连续腹腔注射法建立大鼠冠心病急性、慢性血瘀证模型,取缺血区心肌组织,采用基因芯片对冠心病急性、慢性血瘀证基因表达进行研究,通过GO分析和pathway分析筛选与能量代谢有关的差异基因及目标通路,并选取与能量代谢相关的基因进行荧光定量RT-PCR验证;通过ELISA方法检测心肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及HK、LDH、CACT、ACS、CS的含量;采用GC/TOF-MS平台对冠心病急性、慢性血瘀证心肌组织代谢物进行检测,通过多元变量统计分析及通路富集分析筛选差异代谢物及差异富集的代谢通路。(2)基于Flux Explorer平台构建冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢网络模型,采用血气分析方法检测冠心病急性、慢性血瘀证大鼠动脉血氧含量,结合通过GC/TOF-MS检测的代谢物如葡萄糖、脂肪酸含量,作为能量代谢底物输入心肌细胞能量代谢网络模型,通过FBA方法和SPA方法分析急性、慢性发病对冠心病血瘀心肌细胞能量代谢网络模型的影响。(3)不同致瘀因素对心肌细胞能量代谢及网络模型的影响:(1)ISO腹腔注射结合凝血酶+氨基己酸注射法、动脉粥样硬化斑块法、冷冻应激法、夹尾激怒法复制瘀阻、痰扰、寒凝、气滞4种不同致瘀因素所致大鼠冠心病血瘀证模型,取缺血区心肌组织,采用荧光定量RT-PCR对能量代谢相关基因ME1、CPT2、ACSL1、CS、IDH3A的表达进行检测;通过ELISA方法检测心肌组织中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性及HK、LDH、CACT、ACS、CS的含量;采用GC/TOF-MS平台对不同致瘀因素冠心病血瘀证心肌组织代谢物进行检测,通过多元变量统计分析及通路富集分析筛选差异代谢物及差异富集的代谢通路。(2)基于Flux Explorer平台构建冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢网络模型,采用血气分析方法检测不同致瘀因素冠心病血瘀证大鼠动脉血氧含量,结合代谢组学检测的葡萄糖、脂肪酸含量,三者作为能心肌细胞量代谢网络模型的能量代谢底物输入,通过FBA方法和SPA方法分析瘀阻、痰扰、寒凝、气滞不同致瘀因素对冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢网络模型的影响。结果(1)理论研究:(1)缺血引起心肌能量代谢重构,葡萄糖、脂肪酸、糖原、乳酸等代谢途径均发生了改变。(2)冠心病血瘀证的基本病理是心肌缺血,其发病与心肌细胞能量代谢障碍有密切关系,冠心病血瘀证病机复杂,然其基本病机是“心脉痹阻”,导致“心脉痹阻”的因素常有瘀阻、痰扰、寒凝、气滞等。(3)证候的物质基础可能是由功能相关的基因群或蛋白质群体表达异常及特异代谢组分共同构成,将系统生物学引入中医证候本质的研究中,望更全面、更确切地揭示证候的动态发生机制。(2)不同发病趋势对心肌细胞能量代谢及网络模型的影响:(1)通过对心肌组织基因组学结果分析,发现冠心病急性、慢性血瘀证能量代谢相关的差异基因主要富集于糖代谢、脂质代谢、三羧酸循环、氧化磷酸化、氨基酸代谢等通路,涉及的差异基因以下调为主,荧光定量RT-PCR验证表明基因组检测结果准确可靠。(2)通过能量代谢途径中关键酶分析,冠心病急、慢性血瘀证组Na+-K+-ATP酶活、LDH、CACT、CS含量低于健康对照组(P0.01或P0.05),ACS含量高于健康对照组(P0.01或P0.05),冠心病急性血瘀证组HK含量高于健康对照组(P0.01),慢性血瘀证组HK含量低于健康对照组(P0.01)。(3)通过心肌组织代谢组学多元变量分析,冠心病急性、慢性血瘀证组分布于不同的区域,均可与健康对照组明显区分。差异代谢物分析显示急性、慢性冠心病血瘀证组中均出现下调代谢物的包括糖类如果糖、6-磷酸葡萄糖等,脂肪酸类如油酸、亚油酸等,有机酸类如延胡索酸、琥珀酸等,氨基酸类如谷氨酸等。此外,在急性冠心病血瘀证3组中均出现肌酸、左旋苹果酸和阿洛糖明显上调,在慢性冠心病血瘀证组中未见此三种差异代谢物;急性冠心病血瘀证组麦芽糖、葡萄庚糖上调,而慢性血瘀证组葡萄糖出现下调。通路分析显示,冠心病急性、慢性血瘀证组均涉及的差异显著的通路包括:淀粉和蔗糖代谢,TCA循环,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,氨基糖和核苷酸糖代谢,精氨酸和脯氨酸代谢。此外,急性冠心病血瘀证组差异代谢通路还包括半乳糖代谢及其他氨基酸代谢通路,慢性冠心病血瘀证组差异显著的通路还包括包括不饱和脂肪酸生物合成,脂肪酸生物合成。(4)FBA分析提示能量代谢底物(Gluc、FA、O2)、糖酵解途径中关键酶(Hk、Pfk、Pk)、脂肪酸氧化途径中关键酶(FAO、FACo AT、FAcl)、三羧酸循环途径中关键酶(Cs、Icdh、Od)、氧化磷酸化过程中酶(NADHd、Sdh2)及ATP的生成均呈一致变化趋势,即健康对照组冠心病急性血瘀证组冠心病慢性血瘀证组趋势(P0.05或P0.01)。(5)SPA分析提示Gluc、O2灵敏度变化呈健康对照组冠心病急性血瘀证组冠心病慢性血瘀证组的趋势(P0.05或P0.01),FA灵敏度变化呈冠心病慢性血瘀证组冠心病急性血瘀证组健康对照组的趋势(P0.05或P0.01)。(3)不同致瘀因素对心肌细胞能量代谢及网络模型的影响:(1)通过对心肌能量代谢相关基因检测分析,冠心病瘀阻心脉证组、痰阻心脉证组、气滞心脉证组ME1、CPT2、ACSL1、CS、IDH3A均明显低于相应健康对照组(P0.01或P0.05),冠心病寒凝心脉证组ME1、ACSL1、IDH3A、CS显著低于C4对照组(P0.01),CPT2两组间差异无统计学意义。(2)通过能量代谢途径中关键酶分析,不同致瘀因素冠心病血瘀证模型组Na+-K+-ATP酶活性、CACT、CS含量明显低于相应健康对照组(P0.01或P0.05),且寒凝心脉证组Na+-K+-ATP酶活性、CS含量明显低于瘀、痰、气三组(P0.01),冠心病瘀阻心脉证组、痰阻心脉证组、气滞心脉证组HK、ACS均明显高于相应健康对照组(P0.01),寒凝心脉证组HK、ACS明显低于C3对照组(P0.01),且明显低于瘀、痰、气三个模型组(P0.01),痰阻心脉组、气滞心脉组LDH明显低于C2、C4对照组(P0.01),且寒凝心脉组LDH明显高于瘀、痰、气三个模型组(P0.01或P0.05)。(3)通过心肌组织代谢组学多元变量分析,冠心病不同致瘀因素模型组各自聚集分布于不同的区域,相互之间可明显区分,且4个模型组均可与其相应的健康对照组明显区分。差异代谢物分析显示参与心肌能量代谢的糖类代谢物如葡萄糖、果糖、麦芽糖在瘀阻心脉证组、寒凝心脉证组、气滞心脉证组均上调,在痰阻心脉证组下调,脂肪酸类代谢物在瘀阻心脉证组上调,在痰阻心脉证组、寒凝心脉证组、气滞心脉证组均表现为下调。通路分析显示,4个模型组间未发现共同的差异代谢通路,差异代谢物主要在碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢通路富集。(4)FBA分析提示能量代谢底物Gluc、糖酵解过程中关键酶含量在瘀阻心脉组、寒凝心脉组高于C1、C3对照组(P0.01),,在痰阻心脉、气滞心脉组低于C2、C4对照组(P0.05或P0.01),能量代谢底物FA、O2以及脂肪酸氧化、三羧酸循环、氧化磷酸化过程中的关键酶含量及ATP的生成均呈冠心病血瘀证不同致瘀因素模型组低于相应对照组(P0.05或P0.01)。(5)SPA分析提示冠心病瘀阻心脉组、寒凝心脉组Gluc灵敏度高于C1、C3对照组(P0.05或P0.01),痰阻心脉证组、冠心病气滞心脉证组Gluc灵敏度差异无统计学意义(P0.05),冠心病血瘀证不同致瘀因素4个模型组FA灵敏度明显高于相应对照组(P0.01),而O2灵敏度明显低于相应健康对照组(P0.01)。结论(1)冠心病血瘀证病机复杂,然其基本病机是“心脉痹阻”,导致“心脉痹阻”的因素常有瘀阻、痰扰、寒凝、气滞,其发病与心肌细胞能量代谢障碍有密切关系。(2)冠心病急性、慢性血瘀证均可引起心肌细胞能量代谢的改变,在冠心病急性血瘀证中,心肌细胞能量代谢倾向于增加对葡萄糖的糖酵解利用,在冠心病慢性血瘀证状态下,心肌细胞中有氧代谢、无氧代谢均减弱。(3)不同致瘀因素所致冠心病血瘀证均可引起心肌细胞能量代谢的改变,总体以糖代谢途径增加和脂肪酸代谢途径降低为趋势,其中瘀阻心脉证组、寒凝心脉证组、气滞心脉证组以糖代谢底物的摄取增多为主,痰阻心脉证组以糖酵解途径上调为主。(4)基于Flux Explorer构建的冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢网络模型总体上能够准确预测冠心病急性、慢性血瘀证及不同致瘀因素所致冠心病血瘀证心肌细胞能量代谢底物、能量代谢途径中关键酶的变化趋势以及ATP生成的变化,O2含量对网络模型目标函数ATP生成有关键作用。
[Abstract]:鐩殑鐮旂┒鍐犲績鐥呮，
本文编号：1695378
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