毫菊总黄酮药效学初步评价与其纳米制剂的研讨

【摘要】 目的：采用多种方法对亳菊总黄酮进行药效学的初步研究；通过药代动力学和心肌缺血实验比较亳菊总黄酮（TF）及纳米乳（TF-NE）。方法：采用DPPH法测定亳菊总黄酮清除自由基的能力；采用腹腔注射STZ制备大鼠糖尿病模型，观察亳菊总黄酮对糖尿病大鼠凝血时间，体外血栓长度及干、湿重，全血和血浆粘度，红细胞压积和红细胞沉降速率，以及血清一氧化氮（NO）含量的影响。采用HPLC梯度洗脱，同时测定亳菊总黄酮中三种黄酮苷元成分；制备成亳菊总黄酮纳米制剂，建立了测定大鼠生物样本处理和测定的方法学，并对TF、TF-NE进行了药代动力学研究。采用冠脉结扎法建立大鼠心肌缺血模型，测定血清酶（AST、LDH、CK）活性、凝血时间以及梗死率，比较亳菊总黄酮与纳米乳的差异。结果：亳菊总黄酮具有较强的抗DPPH自由基作用；亳菊总黄酮能显著延长糖尿病大鼠凝血时间，降低体外血栓长度和干、湿重，降低红细胞压积，减慢红细胞沉降速率，升高血清NO含量；实现了RP-HPLC同时测定亳菊总黄酮中木犀草素、芹菜素和金合欢素3种黄酮苷元成分；对亳菊总黄酮纳米乳进行表征，其平均粒径在83.16±12.03nm，zeta电位为-（11.62±6.38）mV，粒径范围较窄，体系较稳定；经透射电镜(TEM)对TF-NE进行形貌观察，制剂成球形或类球形，粒径分布较均匀，无粘连。大鼠灌胃TF-NE与TF-相比，血浆中木犀草素和芹菜素的Tmax都有所推后、吸收半衰期和消除半衰期一定程度的延长、峰浓度Cmax有一定的增加，TF-NE中木犀草素的AUC是原料药的2.52倍，纳米乳中芹菜素的AUC是原料药的3.62倍；木犀草素和芹菜素的相对生物利用度分别为313%和318%。与模型组相比，灌胃TF与TF-NE大鼠血清酶（AST、LDH、CK）活性都有所降低、凝血时间延长、梗死率也有降低，但TF组与TF-NE之间无明显差异。结论：亳菊总黄酮具有抗自由基、抗氧化、改善糖尿病大鼠血液流变学异常的作用。首次采用有效部位——亳菊总黄酮作为药物做成纳米制剂，并使用多指标成分做指标来进行药动学研究。纳米乳能提高总黄酮的生物利用度，TF与TF-NE均具有对抗大鼠急性心肌缺血的作用。 

前 言

随着人们生活水平及质量的不断提高，人民的饮食结构的改变，心脑血管疾病的发病率也呈上升趋势。其危害人类尤其是中老年人的健康，死亡率居各种疾病之首。据有关数据调查，我国由心脑血管引起的死亡人数占总死亡人数的40%左右，药品市场半数药物为心血管病。因此对治疗和预防心脑血管疾病的药品与保健品的开发研究就显得尤为重要。
心肌缺血易引发缺血性心脏病，常伴有血液流变性异常[1]。心肌缺血易引起心肌细胞溶解死亡以及自律性细胞节律的改变，还会出现血浆中酶含量变化。当心肌缺血在短时间内会发生心肌顿抑；血管内皮细胞损伤会使血管栓塞、官腔狭窄，从而引起冠脉堵塞，易引起心肌缺血、缺氧。心脏血液流动如果不畅，就没有足够的氧和营养物质来维持心脏组织的活力。持续一段时间后会引发心肌梗死、心律失常等症状。而心肌梗塞会伴有血液流变学的异常改变，表现为血液、血浆的粘度升高，血沉和压积的增加、红细胞聚集性增加、以及血小板聚集，以致血液循环阻力增加，造成心肌供血不足，严重的可以造成组织细胞坏死。
氧化反应广泛存在，自由基是生物体在新陈代谢时夺走氧原子中的电子，使氧原子变成自由基，能够攻击细胞组织中的脂质、蛋白质、糖类和 DNA 等物质，通过夺取失去的电子达到新平衡，细胞分子失去电子后又形成新的自由基，造成连锁反应会导致细胞膜、遗传因子等的损伤，从而引发严重的疾病。此外，自由基含脂类成分食品酸败——脂质过氧化，使油脂营养丧失，并损害生物膜、蛋白质与活细胞功能，这些产物中有些还是公认的致癌物。许多疾病的产生都与氧化有一定的关系，血液成分中的一些物质能氧化成为过氧化物质，经小肠吸收，通过血液等途径流入机体的组织中产生有害作用。尤其是过氧化脂质会损伤血管细胞内壁，阻碍血液的循环，从而导致脑出血、动脉硬症状的产生。同时，细胞内产生的过氧化脂质易损伤细胞膜与局部组织，自由基还能抑制前列腺素的合成引发血栓，通过形成脂褐素使细胞老化。为了加强防御系统，减少氧化伤害，就必须从体外补充一些抗氧化物质，如食品类抗氧化成分有维生素 C、维生素 E 等；天然抗氧剂有黄酮类、苯酚类、鞣质类、皂苷类等。经证实合成抗氧化剂有致癌作用，由于天然的抗氧成分来源广泛、安全健康，因此从天然产物中寻找更加安全有效的抗氧化剂成为更多国内外学者的共同研究的对象。
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第一章 亳菊总黄酮药效学的初步评价

第一节 DPPH法测定亳菊总黄酮的抗氧化活性
采用 DPPH 法测定亳菊总黄酮的抗氧化作用。DPPH 在有机溶液中是一种稳定的自由基，该溶液特征是紫红色团的吸收峰，具有极强的氧化性。采用比色法测定 DPPH 的吸光度，以加入亳菊总黄酮溶液使其吸光度在 517nm 下的吸光度下降的影响来确定黄酮溶液对 DPPH 的清除能力，以清除率表示[19-24]。测定自由基的清除作用，可以反映其抗氧化活性。经测定结果显示亳菊总黄酮具有较强的抗氧化性，对其进一步研究保护体内局部区域损伤提供依据。
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1 仪器与材料
1.1 仪器
UV-757CRT 紫外分光光度计(上海棱光仪器有限公司)；CP-225D 电子分析天平（德国赛多利斯仪器有限公司）；HH-S2 恒温水浴锅（上海医疗器械五厂制造）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；DZF-200 型真空干燥箱（上海浦东跃欣科学仪器厂）；KP3200B 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2 材料
亳菊总黄酮（自制，总黄酮含量为 76.3%）；DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼)（梯希爱化成工业发展有限公司，批号 00909，纯度 HPLC≧98%）；芦丁对照品（自制，纯度 HPLC≧98%）；甲醇（MeOH）、乙醇(EtOH)为分析纯；水为重蒸馏水。
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第二章 亳菊总黄酮的质量控制及纳米乳的制备............... 30-44 
第一节 总黄酮原料药的质量控制 ...................30-39 
1 仪器与材料................ 30 
2 方法和结果 .................................30-37 
3 讨论 .............................37 
4 小结 ..........................37-39 
第二节 亳菊总黄酮纳米乳的制备与质量评价 ................39-44 
1 仪器与材料....................................... 39 
2 方法和结果 ..........................39-42 
3 讨论............................ 42-43 
4 结论............................. 43-44 
第三章 亳菊总黄酮与纳米乳制剂代动力学比较研究............... 44-60 
1 仪器与材料.......................... 44 
2 方法和结果 ...........................44-58 
3 讨论......................... 58 
4 结论............................... 58-60 

第四章 亳菊总黄酮及其纳米乳制剂抗急性心肌缺血实验

比较亳菊总黄酮及其纳米制剂的对心肌损伤的保护作用。采用冠脉结扎法建立心肌缺血大鼠模型，对比大鼠灌胃 TF 及其 TF-NE 心电图、血清心肌酶（AST、LDH、CK）含量、TTC 染色测定梗死率及凝血时间（PT、APTT）的差异。TF 及其 TF-NE 能对抗冠脉结扎引发大鼠急性心肌缺血模型的心电图 ST 段的抬高，降低血清心肌酶（AST、LDH、CK）活性，明显缩短凝血时间。但 TF 与 TF-NE 之间无明显差异。
1 仪器与材料
1.1 仪器
XD-7100 型单道心电图机（上海医用电子仪器厂），恒温水浴锅。
1.2 药品与试剂
亳菊总黄酮（自制，，总黄酮含量为 76.3%）；红四氮唑（TTC，BIOSHARP 公司，批号：0765）；复方丹参滴丸（天津天士力制药股份有限公司，批号：110361）。
1.3 实验动物
Wistar 大鼠(购自安徽医科大学实验动物中心)，雌雄各半，体重 200~220g，饲养环境为清洁级。
2 方法与结果
2.1 动物分组与给药
实验动物分为 5 组，随机分成假手术组、模型组、阳性组（复方丹参滴丸，140mg/kg）、亳菊总黄酮（TF）组（400mg/kg）、亳菊总黄酮纳米乳（TF-NE）组（400mg/kg）每组 14 只。术前连续 7 天灌胃给药，每天 1 次共 7 天。各组动物按剂量灌胃给药，按体重给予相应体积，假手术组、模型组给予 10mL/kg 等容量的0.5%CMC-Na 溶液。
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总结

通过DPPH法实验证明了菊花总黄酮有清除DPPH自由基作用，本法操作简单，快速，准确，用样量小，为研制天然抗氧化剂以及深入研究药理作用提供依据。
通过大鼠血液流变学实验，明确亳菊总黄酮降低体外血栓长度和干、湿重，降低红细胞压积，减慢红细胞沉降速率，升高血清 NO 含量。因此亳菊总黄酮能够改善大鼠血液流变学异常。
建立心肌缺血模型，初步确定亳菊总黄酮对冠脉结扎所致的心肌缺血具有保护作用。
对亳菊总黄酮原料药进行质量控制，HPLC同时测定其中的三种黄酮苷元成分——木犀草素、芹菜素、金合欢素，并制备了亳菊总黄酮纳米制剂。同时进行药动学比较，发现大鼠灌胃后纳米乳两种苷元成分不同的剂型药物代谢动力学参数有变化，峰值Cmax有一定增加，达峰时间Tmax、血药浓度维持时间分别延长，曲线下面积有所增加，生物利用度有不同程度的提高。
通过心肌缺血模型实验对比亳菊总黄酮及其纳米制剂，研究使用冠脉结扎法引发心肌缺血模型，以心电图ST段的抬高显示心肌缺血模型的建立，以手术后ST段降低程度反映药物对心肌损伤的保护能力，以心肌酶指标判断心肌的伤程度，以梗塞率确定药物降低心肌细胞坏死的能力。证明亳菊总黄酮及其纳米乳对大鼠急性心肌缺血模型有不同程度的保护作用。
药效学初步评价实验中，所做的血液流变学实验中总黄酮的浓度是参照相关的文献暂定的剂量为30，60，120mg/kg。而后来实验过程考虑到药动实验初步采用了TF-NE的最大载药量为400mg/kg，因此心肌缺血药理实验同样采用相同的剂量400mg/kg。
菊总黄酮具有抗自由基、抗氧化、改善糖尿病大鼠血液流变学异常的作用。首次采用有效部位——亳菊总黄酮作为药物做成纳米制剂，并使用多指标成分做指标来进行药动学研究。纳米乳能提高总黄酮的生物利用度，TF与TF-NE均具有对抗大鼠急性心肌缺血的作用。
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参考文献（略）