中药筋脉通对糖尿病周围神经病变氧化应激及神经修复再生的影响

发布时间：2018-10-21 19:54

【摘要】：[研究目的]从整体水平,探讨中药筋脉通对STZ-DM大鼠背根神经节组织NADPH氧化酶p47phox亚基、NT及NGF表达的影响；从细胞水平,探讨筋脉通含药血清对高糖培养背根神经节神经元NADPH氧化酶p47phox亚基、NT、NGF表达及细胞凋亡的影响。[研究方法]第一部分整体水平采用链脲佐菌素(STZ) 60mg/kg一次性腹腔内注射SD大鼠的方法制造糖尿病模型。随机数字表法将成模大鼠分为3组：糖尿病模型对照组(DM)、筋脉通治疗组(JMT)及牛磺酸治疗组(Tau),每组各10只。以体重、鼠龄相匹配的正常大鼠10只作为正常对照组(Con)。成模后予灌胃给药,筋脉通组及牛磺酸组均按成人剂量15倍给药,模型对照组和正常对照组灌服等量蒸溜水(1ml/100g/d)分别于治疗前及治疗后4周、8周、12周及16周检测各组大鼠体重和血糖变化。所有实验大鼠于灌胃16周后进行机械痛阈检测后处死,取大鼠背根神经节(DRG)组织。采用透射电子显微镜观察DRG超微结构变化,免疫组织化学染色法和Western blotting法检测大鼠DRG组织中p47phox亚基、NT及NGF蛋白的表达,实时荧光定量PCR法检测p47phox及NGF mRNA的表达。(因NT是酪氨酸硝基化产物,没有直接编码的mRNA,所以没有进行PCR检测)第二部分细胞水平1.含药血清的制备：雄性SD大鼠随机分为3组,灌胃蒸馏水(20只)制备正常血清；按成人剂量15倍给药灌胃筋脉通(10只)、牛磺酸(10只)制备含药血清。灌胃时间均为1周。2.胎鼠背根神经节神经元的制备：取孕15天(E15)的SD胎鼠脊髓背根神经节神经元(DRGn),采用混合酶分步消化法、Neurobasal无血清神经元专用培养基+B27添加剂+NGF培养基进行原代培养,经密度梯度离心法、差速贴壁法进行细胞纯化,抗MAP-2抗体进行细胞鉴定。3.根据课题组近期研究结果,确定实验组分为4组：正常对照组(Con)、高糖组(HG,45mmol/L葡萄糖)、筋脉通组(JMT)、牛磺酸组(Tau)。最佳干预时间点为贴壁后24小时,后续指标检测时间点为干预后24小时,含药血清添加浓度均为10%。CCK-8法检测细胞活性,TUNEL法检测细胞凋亡。在既往课题组研究结果——筋脉通含药血清能抑制高糖培养背根神经元活性氧簇(ROS)的基础上,用免疫荧光细胞化学法、Western blotting法检测DRGn中NADPH氧化酶p47phox亚基、NT及NGF蛋白的表达,qRT-PCR法检测p47phox亚基及NGF mRNA的表达。[研究结果]第一部分整体水平1.血糖和体重：各造模组大鼠血糖与Con组相比均升高,差异具有统计学意义(P均0.05)；各治疗组血糖在同一时间点与DM组相比无统计学差异(P均0.05)干预前后,同一时间点各治疗组大鼠之间的体重无明显差异(P均0.05)。给药4、8、12、16周各造模组与Con组相比体重下降,差异具有统计学意义(P均0.05)。2.机械痛阈值：与Con组相比,DM组左、右两侧机械痛阈均显著降低(P0.01)；与DM组比较,JMT组及Tau组两治疗组左侧机械痛阈提高(P0.05),右侧机械痛阈显著提高(P0.01)；两治疗组间比较,左、右两侧的差异均无统计学意义(P0.05)。3.透射电镜观察背根神经节超微结构的变化：Con组大鼠背根神经节内细胞超微结构形态完整清晰,线粒体含量丰富且结构正常,核膜较规整。DM组大鼠背根神经节细胞内超微结构出现重度损伤,线粒体肿胀变性,线粒体嵴断裂、减少甚至消失,大部分呈空泡样变。JMT组及Tau组细胞超微结构破坏程度较DM组减轻。4.DRG组织中NADPH氧化酶p47phox亚基、NT及NGF蛋白及mRNA表达结果的比较：①免疫组化法结果显示：与Con组比较,DM组p47phox亚基、NT表达显著升高,NGF表达显著降低(P0.01)。与DM组比较,JMT组p47phox亚基表达降低、两治疗组NT表达均显著下降,NGF的表达量显著升高(P0.01)。与Tau组比较,JMT组NT表达降低,NGF表达显著升高(P0.05或P0.01)。②Western blotting结果显示：与Con组比较,DM组p47phox亚基、NT蛋白表达显著升高,NGF蛋白表达显著降低(P0.01)。与DM组比较,两治疗组p47phox亚基、NT蛋白表达显著下降,NGF的表达显著升高(P0.01)。与Tau组比较,JMT组NGF蛋白表达量升高,且有统计学差异(P0.05),p47phox亚基及NT蛋白表达无差异(P0.05)。③qRT-PCR结果显示：与Con组比较,DM组p47phox亚基mRNA表达量显著升高,NGF显著降低(P0.01)。与DM组比较,两治疗组p47phox亚基mRNA表达量显著下降,JMT组NGF mRNA的表达量升高(P0.01或P0.05)。两治疗组比较,p47phox亚基及NGF mRNA表达量无统计学差异(P0.05)。第二部分细胞水平1 .DRGn细胞调亡率：与Con组比较,HG组的细胞调亡率显著升高(P0.01)；与HG组比较,JMT组和Tau组的细胞调亡率均显著降低(P0.01),JMT组和Tau组的细胞调亡率与Con组比较,差异无统计学意义(P0.05)；JMT组与Tau组之间比较,细胞调亡率无统计学差异(P0.05)。2.透射电镜观察各组DRGn超微结构：与整体部分结果相似,Con组DRGn形态完整清晰,线粒体含量丰富且结构正常,核膜较完整。HG组DRGn出现明显损伤,线粒体肿胀变性,线粒体外膜破坏,线粒体嵴断裂、减少甚至消失,大部分呈空泡样变。JMT组及Tau组DRGn超微结构病变程度较DM组减轻。3. DRGn细胞中p47phox亚基、NT及NGF蛋白及mRNA表达结果的比较：①免疫荧光细胞化学法结果显示：与Con组比较,HG组p47phox亚基、NT表达显著升高,NGF表达显著降低(P0.01)。与HG组比较,两治疗组p47phox亚基及NT的表达均显著降低、NGF的表达均显著升高(P0.01)。与Tau组比较,JMT组NGF表达升高,具有统计意义(P0.05); P47phox亚基及NT的表达无差异(P0.05)。②Western blotting结果显示：与Con组比较,HG组p47phox亚基、NT蛋白表达显著升高(P0.01), NGF蛋白表达显著降低(P0.01)。与HG组比较,两治疗组p47phox亚基、NT蛋白表达显著下降(P0.01),JMT组NGF的表达显著升高(P0.01), Tau组无差异(P0.05)。与Tau组比较,JMT组NGF蛋白表达显著升高(P0.01), P47phox亚基及NT蛋白表达无差异(P0.05)③qRT-PCR结果显示：与Con组比较,HG组p47Phox亚基mRNA表达显著升高,NGF mRNA表达降低或显著降低(P0.01或P0.05)。与HG组比较,两治疗组p47phox亚基mRNA表达显著下降,NGF的表达显著升高(P0.01)。两治疗组比较,p47Phox亚基及NGF mRNA的表达无统计学差异(P0.05)。[结论]第一部分整体水平1.空腹一次性腹腔注射STZ 60mg/kg 72小时后检测血糖值大于16.7mmol/L为造模成功。16周后DM大鼠出现痛觉过敏,提示感觉神经受累,DPN造模成功。DPN大鼠DRG细胞线粒体超微结构严重损伤。2.DPN大鼠背根神经节超微结构损伤,线粒体嵴肿胀,嵴断裂,甚至空泡样变。DRG组织中p47Phox亚基、NT蛋白及mRNA的表达显著升高,NGF蛋白及mRNA的表达显著降低。3.筋脉通可改善DPN大鼠痛觉过敏,减轻超微结构损伤,下调p47phox亚基及NT蛋白及mRNA的表达,上调NGF蛋白及mRNA的表达,免疫组化结果显示,中药筋脉通降低NT及升高NGF蛋白表达的作用优于对照药牛磺酸。第二部分细胞水平1.高糖可显著抑制DRGn细胞活性,高糖培养DRGn细胞凋亡率显著升高,细胞超微结构破坏,线粒体损伤明显。高糖培养DRGn细胞p47phox亚基和NT蛋白及mRNA的表达显著升高,NGF蛋白及mRNA的表达显著下降。2.筋脉通含药血清可提高高糖培养DRGn细胞活性,降低细胞凋亡率,减轻超微结构损伤,下调高糖培养DRGn p47phox亚基及NT蛋白及mRNA的表达,上调NGF蛋白及mRNA的表达,免疫荧光及Western blotting结果显示,筋脉通含药血清升高NGF蛋白表达的作用优于对照药牛磺酸。[创新点]本实验从整体和细胞水平观察中药筋脉通同时对STZ-DM大鼠背根神经节及高糖培养背根神经元氧化及硝化应激,以及神经生长因子的影响,目前未见相同的报道。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R259

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本文编号：2286197