抑菌蒙药复方筛选及其对肠黏膜屏障的作用机制研究

发布时间：2018-10-29 10:24

【摘要】：本研究旨在筛选有效抑制牛源致病性大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)的蒙药复方,并研究其抑菌作用机理和对感染致病性E. coli大鼠肠黏膜屏障的作用和机制,为蒙兽药的开发铺垫基础,为兽用蒙药复方的临床推广应用提供数据和理论依据。本研究分为5个试验,试验1从奶牛直肠粪便中分离鉴定致病性E. coli,并进行了血清型分型、毒力基因和耐药性检测。试验2针对致病性E. coli 01(含有eaeA、 stx1、hlyA和irp2等赋予菌株强致病性的4种毒力基因),通过体外抑菌、正交设计、体内抗菌和药物加味试验筛选了最佳抑菌蒙药复方。试验3研究了试验2中筛选出的3种抑菌蒙药复方对致病性E. coli O1的抑菌作用机理和抗菌谱。试验4选取60只SD大鼠,分别为正常对照组、阴性对照组、阳性对照组、抑菌蒙药复方Ⅲ高、中、低剂量组。除正常对照组外其余5组分别灌胃灭菌生理盐水、0.13 g/kg环丙沙星、2.16 g/kg抑菌蒙药复方ⅢK 1.08 g/kg抑菌蒙药复方Ⅲ 0.54 g/kg抑菌蒙药复方Ⅲ,连续7 d,2次/d,并于第五天末次给药1h后腹腔注射80%最低致死量的E. coli O1。试验结束后,采集样品,进行肠黏膜屏障相关指标的检测,研究了抑菌蒙药复方Ⅲ对感染致病性E. coli O1大鼠肠黏膜屏障的作用机制。试验5以RAW264.7细胞为巨噬细胞模型,采用MTT法测定抑菌蒙药复方Ⅲ和E. coliO1对RAW264.7细胞的最适作用时间和浓度,并将试验分为正常对照组、E. coli O1感染组、抑菌蒙药复方Ⅲ组和抑菌蒙药复方Ⅲ干预组,采用ELISA和试剂盒测定培养上清液中细胞因子、细胞存活率、ACP和LDH含量,探索了抑菌蒙药复方Ⅲ对巨噬细胞活性和免疫功能的影响。研究结果如下：试验1：从奶牛直肠采集的100份粪便样品中分离鉴定出50株致病性E. coli,其中有24株菌分布于10种血清型,优势血清型为018、0146和0152；该50株致病性E. coli毒力基因的检出率从高到低：irp2 eaeAstxl stx2 hlyA A,未检出bfpA、st和lt；同时,10种血清型E.coli均对青霉素、四环素、多西环素、利福平、复方新诺明和阿莫西林等6种抗生素耐药,表现为多重耐药性。本研究中发现,致病性E. coli O1致小鼠死亡时间最快、病变最明显,并含有eaeA、stxl、hlyA和irp2等赋予菌株强致病性的4种毒力基因。因此,选取E. coli O1作为本研究的供试菌。试验2：针对致病性E. coli O1,筛选出3种抑菌蒙药复方,分别为朝您·哈日莫各、给喜古讷、阿如拉等7味蒙药组成的抑菌蒙药复方Ⅲ；古日古木、给喜古讷、阿如拉等5味蒙药组成的抑菌蒙药复方Ⅳ；当棍、浑钦、给喜古讷等7味蒙药组成的抑菌蒙药复方V。试验3：3种抑菌蒙药复方均能不同程度地抑制致病性E.coli O1,且对人工感染E. coli O1的小鼠有保护作用,其中抑菌蒙药复方Ⅲ的保护率与环丙沙星相当,达到50%;3种抑菌蒙药复方通过降低E. coli O1细胞表面疏水性、破坏细胞壁和细胞膜的完整性,使细胞内大分子物质外渗,抑制E. coli O1的蛋白表达,从而达到抑菌效果。此外,3种抑菌蒙药复方有较广的抑菌谱。试验4：①与正常对照组相比,阴性对照组大鼠盲肠乳酸菌和双歧杆菌数量显著降低(P0.05),抑菌蒙药复方Ⅲ中剂量组的乳酸菌和双歧杆菌数量无显著性差异(P0.05)。②与空白对照组相比,阴性对照组回肠黏膜ITF含量显著降低(P0.05),抑菌蒙药复方Ⅲ中剂量组和阳性对照组的ITF含量无显著性差异(P0.05)。③阴性对照组与空白对照组相比,大鼠小肠绒毛变短、水肿、断裂脱落,绒毛长度、隐窝深度、V/C(绒毛长度／隐窝深度)值、肌层厚度均出现减小趋势,TJ结构受损、DE异常、微绒毛紊乱变短,回肠黏膜OCCLUDIN？CLAUDIN-1和Z0-1蛋白含量和mRNA基因表达水平显著下降(P0.05),血清DAO、D-乳酸和内毒素含量显著增高(P0.05),并出现细菌移位现象。但抑菌蒙药复方Ⅲ高、中剂量组和阳性对照组中上述情况均得到显著的改善和修复。④阴性对照组与空白对照组相比,大鼠回肠黏膜sIgA、IL-2、IL-10、IFN-y和TGF-β1含量显著降低(P0.05), IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量显著提高(P0.05)；抑菌蒙药复方Ⅲ高、中剂量组和阳性对照组与阴性对照组相比,大鼠回肠黏膜sIgA、IL-2、IL-10、 IFN-y和TGF-｛1含量显著提高(P0.05), IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a含量显著降低(P0.05)。由此可知,E. coli O1可破坏肠黏膜屏障(生物、化学、物理和免疫屏障),但高和中剂量的抑菌蒙药复方Ⅲ能显著改善和修复E. coli O1引起的大鼠肠黏膜屏障损伤,其中抑菌蒙药复方Ⅲ中剂量的效果最佳。试验5：抑菌蒙药复方Ⅲ对RAW264.7细胞作用的最佳有效浓度为10-2g/mL,最佳作用时间为12h; E. coli O1对RAW264.7细胞的半数细胞毒性浓度为106CFU/mL,作用时间为2h; E.coli O1感染组测定的细胞因子含量均显著提高(P0.05),细胞存活率显著降低(P0.01),胞外LDH活力显著提高(P0.01)胞内LDH和ACP含量显著降低(P0.01)。抑菌蒙药复方Ⅲ组IL-1β、IL-12、TNF-α. IFN-γ和IL-10显著提高(P0.05),但其含量显著低于E. coli O1感染组;抑菌蒙药复方Ⅲ干预组与E. coli O1感染组相比,细胞因子含量均显著降低(P0.05),细胞存活率显著提高(P0.01),胞外LDH活力显著降低(P0.01),胞内LDH和ACP显著提高(P0.01)。由此可知,抑菌蒙药复方111能够提高巨噬细胞的吞噬和免疫功能,从而增强对入侵的致病性E. coli O1的吞噬和杀伤作用。
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【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R29
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本文编号：2297427