电针对炎性痛大鼠脊神经节和脊髓背角中钙结合蛋白阳性神经元的影响

发布时间：2019-06-03 03:29

【摘要】：炎性痛是病理性疼痛的一种,指在伤害性刺激清除后还持续存在疼痛的病理现象,是临床上疼痛病症中最常见的类型之一。由于本身炎性痛病程的反复迁延,治疗难度比较大,从而严重影响人们的生活质量,因此其外周和中枢机制一直是近几年研究的焦点。目前,临床上治疗炎性痛主要利用药物对外周敏化产生抑制作用:首先是非甾类抗炎药:炎症反应发生时,环氧化酶活性的抑制作用增强,前列环素的生成减少,从而达到缓解炎性减轻疼痛的目的,但会引起胃肠不适以及肾功能不全等副作用;其次是阿片类制剂,本身是由广泛分布于外周组织中的免疫细胞所生成的。在炎症状态下初级神经元上的部分阿片受体数量会增加,系统或者局部给予一定的阿片化合物能够减轻炎性痛,但是其本身对神经系统的奖赏效应或强化作用易产生成瘾性;最后是大麻素类,在炎症模型中,局部给予大麻酯受体激动剂能活化大麻素受体1被动激活腺苷酸环化酶从而阻断初级传入纤维的兴奋性来达到镇痛的目的,但会引起神经毒作用。近年来针对中枢敏化治疗的药物如去甲肾上腺素再摄取抑制剂、五羟色胺和抗癫痫药等在炎性痛的应用上都暴露了它们疗效的不充分性,因此寻求更加安全、有效、简洁、方便的治疗手段势在必行。临床实践和实验研究都证明了针灸对于炎性痛能够起到良好的镇痛作用,但是其确切机制尚不清楚。普遍认为研究针刺治疗炎性痛的重要渠道是炎性痛与受体、离子通道和神经递质之间关系。同时,最新的研究证实伤害性感受神经元内游离的钙离子和电压门控钙离子通道开合状态在外周和中枢敏化过程中发挥了重要作用,而钙结合蛋白通过其特殊的化学结构-EF手型能够特异性结合游离的钙离子,影响胞质内钙离子浓度,从而使细胞内部信号传导产生变化,最终达到缓解疼痛的目的。为了研究电针在上述过程中发挥的作用,本研究采用完全弗氏佐剂(Complete Freund's adjuvant,CFA)模型大鼠作为研究对象,综合运用行为学、形态学、分子生物学以及生理学等方法深入研究电针对炎性痛模型大鼠脊神经节和脊髓背角中钙结合蛋白(Calcium binding protein,CaBP)的影响,分析电针通过调节钙结合蛋白的表达来改变神经元内部钙离子浓度以及胞内信号转导途径,进而调节神经递质如CGRP、Glu等的释放和神经元的兴奋性以及突触后模N-methyl-D-aspartic acid(NMDA)受体激活数量,最终改善脊髓背角中枢敏化状态,为揭示电针镇痛机制提供有效的理论依据。目的探讨电针刺激足三里穴对炎性痛大鼠脊神经节和脊髓背角钙结合蛋白阳性神经元的影响,进一步揭示针刺通过调节钙结合蛋白的表达变化而产生镇痛作用的分子生物学机制,更好的服务于临床应用。方法取清洁级雄性SD大鼠64只,随机分为空白组(Control)、对照组(Nacl)、模型组(CFA)及电针组(CFAEA)4组,每组16只。其中对Nacl组左侧足底注射50ul的0.9%Nacl溶液,CFA组和CFAEA组在相同部位注射等量的完全弗氏佐剂造模,48h后,对四组大鼠利用异氟烷气雾设备进行麻醉,同等条件下对CFAEA组进行30min电针干预一次,刺激强度为1mA、2mA和3mA各1Omin,频率为20/1OOHz,交替波,干预时间在早上11点至12点之间进行,针刺部位为CFA造模区同侧肢体的足三里穴区。运用行为学检测方法机械刺激和热刺激分别于造模前、造模后和电针后三个阶段测定各组大鼠足底的痛阈变化。即刻利用4%甲醛灌流或直接断头取材分别采用荧光免疫组织化学法及蛋白印迹法检测大鼠脊神经节(Dorsal root ganglion,DRG)和脊髓背角中相关钙结合蛋白的表达变化,并利用统计学原理对相关数据进行分析。结果1.各组大鼠在电针干预后的行为学变化热痛阈:Contral组与Nacl组,在实验进行的三个阶段无论是同组内部还是组间比较基本一致;CFA组和CFAEA组在造模前与CFA组和Nacl组相比没有明显变化,在造模后其数值下降(P0.05);在电针后CFAEA组相比于CFA组数值上升(P0.05)。机械痛阈:CFA组与Nacl组,在实验进行的三个阶段无论是同组内部还是组间比较虽有差异但无统计学意义。电针前,CFA组和CFAEA组与CFA组和Nacl组相比痛阈数值下降(P0.05);电针后,CFAEA组相比于CFA组数值上升(P0.05)。2.电针前后PV、CB以及NECAB1\2阳性神经元在相关脊神经节的表达变化PV、CB以及NECAB1\2阳性神经元在Control组、Nacl组、CFA组和CF AEA组中的表达趋势变化不大,Control组和Nacl组相比没有明显的区别,CF A组与Control组和Nacl组相比表达下调(P0.05),CFAEA组与CFA组相比表达上调(P0.05);同时,对降钙素基因相关肽(Calcitonin gene related pepti de,CGRP)阳性细胞数进行定量统计发现,CFA组相比于Control组和Nacl组有轻度的上调,CFAEA组与CFA组相比表达下调。其中四组中降CGRP阳性细胞数目同组比较呈现较好的一致性(Control组30.1 ± 3.4个,Nacl组28.3 ±9.4 个,CFA 组 45.0 ± 6.7 个,CFAEA 组 33.5 ± 8.7 个)。对PV、CB以及NECAB1\2阳性神经元进行计数发现,在DRG神经元中约有70～80%都是与疼痛相关相关的中、小型神经元,而且在各组中都有不同程度与经典疼痛递质 CGRP 的共表达(PV:1.1 ± 3.76%,CB:1.2 ± 10.5%,NECAB1:28±6.17%,NECAB2:16.2±3.94%)。3.电针前后PV、CB以及NECAB1\2阳性表达物在相关脊髓节段背角的变化在Control组、Nacl组、CFA组和CFAEA组四组的脊髓背角中PV、CB、NECAB1以及NECAB2阳性物质的表达趋势基本一致,并且在与疼痛相关的脊髓背角浅层都有大量的分布,四种蛋白基本不与肽能CGRP阳性纤维共表达。通过对背角同等倍率放大的等大视野内钙结合蛋白阳性神经元胞体周围的跨神经节投射过来的CGRP阳性纤维进行统计发现四种蛋白在Control组、Nacl组、CFA组和CFAEA组中的趋势基本呈现一致性(Control组49.5 ± 5.8个,Nacl组 50.4 ± 4.4 个,CFA 组 75.9 ±7.7 个,CFAEA 组 48.7 ±6.7 个),Control 组和Nacl组相比变化不明显,CFA组与Control组和Nacl组相比表达上调(P0.05),CFAEA组与CFA组相比表达下调(P0.05)。WB结果显示,PV、CB和NECAB1\2在脊髓背角的蛋白含量在Control组、Nacl组、CFA组和CFAEA组变化趋势呈现相对的一致性,Control组和Nacl组相比无明显变化;在造模后,CFA组和CFAEA组相比于Control组和Nacl组蛋白含量下降(P0.05);CFAEA组在电针干预后蛋白含量上升(P0.05)。结论:本研究通过行为学、组织化学以及分子生物学的方法探讨了针刺对于炎性痛的镇痛机制。钙结合蛋白和肽类神经纤维共同参与了针刺镇痛过程,在这个过程中电针能够有效地增加病理状态下脊神经节和脊髓背角中PV、CB和NECAB1\2阳性神经元的数量,同时使伴随的肽类阳性神经纤维表达量下调。电针可能通过四种钙结合蛋白缓冲细胞内部游离钙离子来实现对炎性痛的镇痛作用,同时钙结合蛋白与肽类神经纤维之间在针刺镇痛过程中相互关联的内在机制还有待进一步的探讨。
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【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R245

【参考文献】