益气健脾抗癌法对大肠癌组织PKC影响的实验研究

发布时间：2019-06-16 13:13

【摘要】：目的:作为一种蛋白激酶C,PKC在肿瘤生长、脾功能以及肿瘤血管形成等方面发挥着重要的作用,特别是其中的四个亚型:PKCδ、PKCε和PKCα以及PKCβ,具有调节肿瘤发展的作用。前期临床和实验研究证明,益气健脾抗癌法具有抗癌和改善症状的作用,正在进行的实验研究已经初步表明,益气健脾抗癌法的改善症状作用是通过提高脾功能实现的,提高肝、脾、肾组织中与脾虚相关的PKC表达是其健脾的作用机理之一。为了进一步研究益气健脾抗癌法对肿瘤的影响,分析本法对肿瘤组织中PKC及四个亚型(PKCδ、PKCε、PKCα、PKCβ)作用,我们进行了本项研究。在本研究课题中,以PKC干预作用为出发点,对益气健脾抗癌法在影响大肠癌组织瘤体微血管密度和细胞凋亡等方面所具有的作用进行深入分析,探索益气健脾抗癌法对大肠癌组织PKC蛋白及其亚型PKCδ、PKCε蛋白表达的作用,研究益气健脾抗癌法对大肠癌组织VEGF、PKCα、PKCβ蛋白表达的影响。这将为益气健脾抗癌法的临床应用提供新的实验室依据,奠定益气健脾抗癌中药在大肠癌治疗中的地位,使更多大肠癌患者的生活质量和抗癌治疗效果得到提高。材料与方法:1.实验动物及瘤株:人肠癌HT-29细胞,购于中科院细胞库;选取15只雌裸鼠和15只雄裸鼠,体重保持在18g-22g之间,鼠龄为4周--5周左右。2.药物制备:益气健脾中药、抗癌中药、益气健脾抗癌中药提取液的制备:益气健脾中药由太子参、茯苓、白术、甘草、砂仁、木香、陈皮、法半夏组成,抗癌中药由山慈菇、土茯苓、浙贝母、白花蛇舌草、薏苡仁、莪术、半枝莲组成,益气健脾抗癌中药主要包含上述两种中药,在辽宁省中医院门诊药局将这些中药一次性采购齐全。而后对上述2种中药分别进行10倍水煎煮2h,8倍水煎煮1h,将获取的2次煎熬汤进行过滤处置,去除药渣,将药液浓度提升至3.3g/ml,存放于10ml的小瓶之中,高压灭(0.1-0.15KPa)15min,4℃冰箱保存备用。3.人大肠HT-29细胞悬液及瘤鼠制备:选取对数生长期肿瘤细胞,将细胞浓度调整为1×107/ml,在裸鼠右腋下方实施碘消毒,选用型号为1ml的注射器在小鼠右腋下接种肿瘤细胞液0.2ml/只鼠,整个操作过程均要求无菌操作,每天观察肿瘤的生长情况。在成功接种15天之后,先前接种位置形成直径为0.8cm且质地比较硬的肿瘤结节则被视为瘤。4.动物分组及给药:动物分组:将30只裸鼠进行统一编号,而后通过随机分组的方式将其分成三组,一是模型组,二是益气健脾组,三是益气健脾抗癌组。每组8只。给药:模型组予生理盐水、益气健脾组给予益气健脾中药;益气健脾抗癌组采用益气健脾中药与抗癌中药相结合的治疗方式,不间断服药2周,在第14天的时候,通过脱颈椎方式将实验小鼠致死,彻底剥离瘤体之后将其放在冰盒中,通过肉眼对瘤组织进行观察,而后将肿瘤全层组织进行剖切,多部位采取样本以防肿瘤组织坏死。5.检测指标:肿瘤细胞凋亡检测、肿瘤瘤体微血管密度检测(mvd)、肿瘤细胞vegf表达测定(pcr、westenblot)。应用pcr、westenblot两种方法测定肿瘤组织总pkc、pkcδ、pkcε、pkcα、pkcβ表达结果。结果:1.就肿瘤细胞凋亡率而言,模型组偏低,而益气健脾组很高,益气健脾组肿瘤细胞凋亡率最高,三者凋亡率分别为3.8±1.2、13.8±2.6、36.2±6.6。与模型组相比,益气健脾组和益气健脾抗癌组皆存在明显差异即存在统计学意义(p0.01),与益气健脾组相比,益气健脾抗癌组的细胞凋亡率更高,两者差异明显具有统计学价值(p0.01)。瘤体微血管密度,模型组和益气健脾组以及益气健脾抗癌组依次为0.227±0.012、0.218±0.010、0.189±0.011,呈现逐渐下降的趋势。益气健脾组虽然下降但无统计学意义,但益气健脾抗癌组下降显著,相对于模型组和益气健脾组而言,差异明显具有统计学意义(p0.01)。2.模型组和益气健脾组以及益气健脾抗癌组的pkcmrna依次是0.596±0.021、0.540±0.015、0.412±0.040,益气健脾组和模型组两者之间存在明显不同(p0.05),而益气健脾抗癌组和模型组之间所具有的不同更加显著(p0.01),并且益气健脾组和益气健脾抗癌组两组间亦存在明显不同(p0.05);三组pkc蛋白分别为0.665±0.016、0.498±0.018、0.261±0.019,益气健脾组与模型组对比均有显著性差异(p0.05),而益气健脾抗癌组与其他两个小组之间所具有的不同更为显著(p0.01)。三组pkcδmrna分别为0.233±0.025、0.261±0.034、0.410±0.030,由此可知,益气健脾抗癌组与其他两组间皆存在明显不同(p0.01)。三组pkcδ蛋白分别为0.301±0.041、0.361±0.044、0.516±0.029,模型组和益气健脾组之间存在明显不同(p0.05),而益气健脾抗癌组与模型组、益气健脾组之间的差异均更加明显(p0.01)。三组pkcεmrna分别为0.368±0.044、0.359±0.029、0.224±0.029,益气健脾抗癌组与其他两组相比,皆存在明显不同(p0.01);三组pkcε蛋白分别为0.362±0.021、0.314±0.031、0.215±0.021,益气健脾组和模型组之间存在明显不同(p0.01),益气健脾抗癌组与其他两组相比皆存在显著不同(p0.01)。3.三组vegfmrna分别为0.447±0.024、0.405±0.033、0.307±0.026,益气健脾组和模型组相比存在明显不同(p0.05),而益气健脾抗癌组和模型组之间所具有的不同更加显著(p0.01),并且益气健脾组和益气健脾抗癌组两组间亦存在明显不同(p0.01);三组vegf蛋白分别为0.325±0.037、0.303±0.022、0.230±0.031,益气健脾组和模型组相比存在明显不同(p0.05),而益气健脾抗癌组和其他两组之间的差异尤为明显(p0.01)。三组pkcαmrna分别为0.590±0.017、0.472±0.025、0.392±0.025,益气健脾组和模型组之间存在明显不同(p0.01),而益气健脾抗癌组与模型组、益气健脾组之间均有显著性差异(p0.01);三组pkcα蛋白分别为0.566±0.024、0.522±0.021、0.335±0.025,益气健脾组和模型组之间存在明显不同(p0.05),而相对而言,益气健脾抗癌组和其他两组之间所存在的差异尤为明显(p0.01)。三组pkcβmrna分别为0.583±0.029、0.471±0.039、0.400±0.024,益气健脾组和模型组之间存在明显不同(p0.01),而益气健脾抗癌组与模型组、益气健脾组之间均有显著性差异(p0.01);三组pkcβ蛋白分别为0.542±0.061、0.414±0.081、0.292±0.040,益气健脾组和模型组之间存在明显不同(p0.01),而益气健脾抗癌组其他两组之间亦存在显著不同(p0.01)。结论:1.益气健脾法及益气健脾抗癌法对大肠癌均具有治疗作用,且在促使肿瘤细胞凋亡、控制大肠癌微血管形成等方面具有一定功效,益气健脾法与抗癌法联合应用后疗效得到进一步的提高。2.益气健脾法对pkc、pkcε的mrna及蛋白具有抑制作用,且益气健脾法与抗癌法联合应用时这种抑制作用明显增强。益气健脾法能促进pkcδmrna及pkcδ蛋白,当益气健脾法与抗癌法联合应用时这种促进作用更加明显。益气健脾抗癌法通过对大肠癌组织pkc、pkcε的抑制及pkcδ的促进作用,最终实现了对大肠癌细胞生长的抑制,这可能是益气健脾抗癌法治疗大肠癌的作用机理之一。3.益气健脾抗癌法能控制肿瘤血管形成相关的pkcα、pkcβmrna之类的调控基因、抑制其蛋白表达,以及控制肿瘤血管形成基因vegfmrna、抑制其蛋白表达,从而发挥对肿瘤血管的抑制作用,对vegf、pkcα、pkcβ三方面的影响可能是其重要的作用机理。
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【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R273

【参考文献】