【摘要】：目的:对发酵虫草菌粉治疗慢性阻塞性肺疾病的临床疗效进行系统评价;采用香烟烟雾熏染联合气管内滴注脂多糖建立COPD大鼠模型,比较不同工艺发酵虫草菌粉对COPD大鼠的作用,从中筛选出效果较佳的工艺,并进一步探讨发酵虫草菌粉对COPD大鼠的作用机制。方法:1.计算机检索CNKI、VIP、WanFang、CBM、PubMed、EBSCO和The Cochrane Library数据库中发酵虫草菌粉(Cs-4)治疗COPD的临床随机对照试验,检索时间均从建库至2019年2月12日。按照Cochrane系统评价方法筛选文献、提取资料并评价质量后采用RevMan5.3软件进行Meta分析。2.采用香烟烟雾熏染联合气管内滴注脂多糖建立COPD大鼠模型,分批给予六种不同工艺的发酵虫草菌粉高剂量(1.2g·kg~(-1))和低剂量(0.3g·kg~(-1)),使用WPB PLT-UNR-RT-2型小动物肺功能检测系统检测大鼠肺功能,通过HE染色及AB-PAS染色检测大鼠肺组织病理形态学改变。3.采用香烟烟雾熏染联合气管内滴注脂多糖建立COPD大鼠模型,给予筛选出的发酵虫草菌粉A、F低(0.3g·kg~(-1))、中(0.6g·kg~(-1))、高剂量(1.2g·kg~(-1)),试剂盒法检测COPD大鼠血清IL-8、肺组织匀浆TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ,血清SOD、MDA、CAT及支气管肺泡灌洗液SOD、CAT含量;通过HE染色及AB-PAS染色检测COPD大鼠肺组织病理形态学改变。4.提取肺组织蛋白,采用Nano-LC-LTQ-Orbitrap技术分析蛋白样品,使用Protein Discovery软件进行蛋白质鉴定,SIEVE软件进行相对定量定性分析,用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查找蛋白相关信息。结果:1.最终纳入21项随机对照试验,共1772例患者。发酵虫草菌粉(Cs-4)制剂能提高稳定期COPD患者总有效率[RR=1.27,95%CI(1.19,1.35),P0.00001],降低血清TNF-α含量[MD=-10.86,95%CI(-15.15,-6.56),P0.00001],改善血清SOD含量[MD=231.95,95%CI(52.92,410.97),P=0.01],改善FEV_1[MD=0.25,95%CI(0.08,0.42),P=0.004],改善FEV_1%[MD=9.17,95%CI(5.01,13.32),P0.0001],降低SGRQ评分[MD=-6.02,95%CI(-8.97,-3.07),P0.0001],提高血清IgA水平[MD=0.49,95%CI(0.40,0.58),P0.00001],提高外周血Th17/Treg[MD=0.12,95%CI(0.05,0.18),P=0.0002],提高动脉血PaO_2[MD=3.54,95%CI(0.70,6.39),P=0.01];但在改善TGF-β1、FVC、FEV_1/FVC、PaCO_2、6MWT方面试验组与对照组无差异。发酵虫草菌粉(Cs-4)制剂能改善急性加重期患者FVC[MD=0.56,95%CI(0.41,0.71),P0.00001],在改善FEV_1方面试验组与对照组无差异。2.COPD模型组大鼠PEF、EF50、Cdyn明显降低(P0.01,P0.05),LR升高(P0.05)。菌粉F高剂量能降低LR水平(P0.05);各菌粉高剂量有不同程度升高PEF、EF50值的趋势,菌粉A、D、E、F高剂量能够升高Cdyn,菌粉B、C、D、E高剂量有降低LR的趋势,但无统计学意义。菌粉A、D、E、F低剂量能不同程度升高PEF,菌粉D、E、F低剂量能不同程度升高EF50,各低剂量菌粉均能升高Cdyn,菌粉A、C、D、E、F低剂量能不同程度降低LR值,但均无统计学意义。说明除菌粉F高剂量能改善COPD大鼠LR值外,其余不同工艺菌粉高、低剂量对COPD大鼠肺功能指标的改善作用不明显。正常组大鼠支气管黏膜纤毛柱状上皮细胞排列整齐,未见杯状细胞,小支气管管壁及周围较少炎症细胞浸润,肺泡结构完整。COPD模型组大鼠支气管黏膜上皮坏死、脱落、紊乱,黏膜皱襞增多高耸,突入管腔,管腔变小、狭窄,腔内黏液分泌,小支气管管壁及周围有明显炎症细胞浸润,平滑肌增生肥厚,部分肺泡破裂,肺泡腔扩大,相互融合,出现肺大泡,符合COPD的特征性病理改变。阳性组大鼠支气管黏膜上皮无脱落紊乱,小支气管管壁及周围极少炎症细胞,管腔无变小狭窄,腔内无黏液分泌,肺泡腔有轻度融合扩大现象。不同工艺菌粉给药组大鼠支气管黏膜上皮有脱落紊乱改变,黏膜皱襞高耸,管腔变小狭窄,管壁及周围有炎症细胞浸润,肺泡腔有不同程度的扩大融合改变,与模型组比较相对较轻。结合HE染色评分,COPD模型组病理切片评分显著高于正常组(P0.01),各工艺菌粉高剂量组大鼠HE染色评分降低,但均无统计学意义;而菌粉A、F低剂量组HE染色评分显著降低(P0.01)。正常组大鼠小支气管管腔糖原分泌极少,COPD模型组大鼠分泌糖原显著增多(P0.01),菌粉B、D、E、F高剂量组大鼠糖原分泌显著降低(P0.01,P0.05),菌粉A、D、E、F低剂量组大鼠糖原分泌显著降低(P0.01,P0.05)。3.COPD模型组大鼠血清IL-8及肺组织匀浆中TNF-α和IL-6水平均明显高于正常组(P0.01),与模型组相比,菌粉F低、中、高剂量组大鼠血清IL-8、肺组织匀浆IL-6水平明显降低(P0.01,P0.05),菌粉F低剂量组大鼠肺组织匀浆TNF-α水平明显降低(P0.05),菌粉A仅高剂量组大鼠肺组织匀浆中IL-6水平降低(P0.01)。COPD模型组大鼠肺组织匀浆中IFN-γ低于正常组(P0.05),与模型组相比,发酵虫草菌粉A低、中剂量组IFN-γ水平升高(P0.01,P0.05);COPD模型组大鼠肺组织匀浆中IL-4及IL-4/IFN-γ水平高于正常组(P0.01,P0.05),与模型组相比,发酵虫草菌粉F低、中剂量组IL-4水平降低(P0.05),发酵虫草菌粉A、F各剂量组IL-4/IFN-γ均降低(P0.01,P0.05)。COPD模型组大鼠血清中MDA含量高于正常组(P0.05),与模型组相比,菌粉A低剂量组和菌粉F低、中剂量组MDA含量均降低(P0.01,P0.05);COPD模型组大鼠血清及支气管肺泡灌洗液中SOD、CAT含量均低于正常组(P0.01,P0.05),与模型组相比,菌粉F中剂量组血清及支气管肺泡灌洗液中SOD、CAT含量显著升高(P0.01,P0.05),菌粉A高剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中SOD含量显著升高(P0.01),菌粉A中、高剂量组血清中CAT含量显著升高(P0.01)。阳性组大鼠管腔平滑肌轻度增生,肺泡融合不明显;发酵虫草菌粉A中、高剂量组,发酵虫草菌粉F低、中剂量组大鼠管腔黏液分泌、管腔狭窄及支气管黏膜损伤较模型组改善明显,发酵虫草菌粉A低剂量组,发酵虫草菌粉F高剂量组支气管损伤较模型组改善不明显。菌粉A中、高剂量组和F低、中剂量组大鼠HE染色评分显著降低(P0.01,P0.05),菌粉A中剂量组及F低剂量组大鼠糖原分泌降低(P0.01,P0.05)。4.蛋白质组学分析结果显示,发酵虫草菌粉组与模型组相比,差异蛋白主要涉及上皮间质转化、细胞外基质、细胞骨架蛋白相关的气道重塑,损伤凋亡,免疫炎症,生物氧化,能量代谢,糖代谢,脂代谢等相关蛋白。结论:1.发酵虫草菌粉(Cs-4)对COPD患者有治疗作用,尤其能提高稳定期COPD患者治疗总有效率,降低炎症因子TNF-α水平,提高抗氧化酶SOD活性,改善肺功能及免疫功能相关指标。受纳入文献质量和数量所限,仍需要大样本、高质量的临床研究加以证实。2.六种不同工艺发酵虫草菌粉对COPD大鼠的肺功能改善不明显,但是能不同程度降低COPD大鼠肺组织病理损伤程度及黏液高分泌状态,菌粉A和F作用较好。3.发酵虫草菌粉A、F能从降低COPD大鼠肺组织病理肺损伤程度,黏液高分泌状态,降低COPD大鼠体内促炎因子的水平,调节Th2/Th1的失衡,降低氧化损伤的程度来发挥对COPD大鼠的防治作用,并且其中发酵虫草菌粉F的作用更为突出。4.S100 A11钙结合蛋白、β-连环蛋白、胶原蛋白IV、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D等蛋白可能是发酵虫草菌粉防治COPD的作用靶点。
【图文】：
采用 Cochrane 手册 5.1 版偏倚风险评估工具中的风险，包含随机分配方案，分配方案的隐藏，对患者价者盲法的实施，结果数据的完整性，有无选择性报 使用 Rev Man 5.3 软件对数据进行分析。非连续变度（RR）和 95%可信区间（CI），连续变量的效应指5%CI。若 P≥0.1，I2≤50%，说明各研究间无异质性若 P＜0.1，I2＞50%，说明各研究间存在异质性，寻找或敏感性分析；若未能找出异质性来源，采用随机效 初步检索共获得 504 篇原始文献，经过进一步筛1772 例患者。文献检索流程如图 1 所示。
图 2 试验组与对照组总有效率的森林图Figure 2 The forest plot of total effective rate in the experimental groupand the control group10 项研究[26,27,29,31,32,34,35,38,41,44]报告了稳定期总有效率，见图 2，，各研究间无统计学异质性（P=0.91，I2=0%），采用固定效应模型分析，提示试验组总有效率优于对照组[RR=1.27，95%CI（1.19，1.35），P<0.00001]。另有 1 项研究[37]报告了急性加重期总有效率，结果表明试验组总有效率优于对照组[RR=1.17，95%CI（1.01，1.35），P=0.04]。2.3.2 血清 TNF-α 含量图 3 试验组与对照组血清 TNF-α 含量的森林图Figure 3 The forest plot of serum TNF-α content in the experimental group
【学位授予单位】：江西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R259
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2591471
